南極大磷蝦(Euphausia superba)胰蛋白酶樣酶分離純化、酶學(xué)性質(zhì)探索及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、南極大磷蝦隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱,是南極生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵物種,資源豐富,具有巨大的開發(fā)和利用潛力。國(guó)外研究表明,南極大磷蝦體內(nèi)含有多種蛋白酶,能清除機(jī)體壞死組織和細(xì)胞、治療角膜堿燒傷和消除牙斑等,具有廣泛的醫(yī)學(xué)用途,而其體內(nèi)蛋白酶活性40％來(lái)源于胰蛋白酶。因此,對(duì)其胰蛋白酶樣酶進(jìn)行分離純化,酶學(xué)性質(zhì)探索和生物學(xué)活性研究,具有一定的理論和應(yīng)用價(jià)值。
　　 本文采用20-70％飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephacryl S100凝膠過(guò)濾

2、柱層析和DEAE Sepharose-F.F離子交換柱層析,純化得到一種胰蛋白酶TLEⅠ,分子量大約在30.0KDa,純化倍數(shù)為3.19。
　　 胰蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn):酶促反應(yīng)的速率受pH、溫度影響。在37℃,以BApNA為底物的反應(yīng)體系中,在較廣泛的pH范圍(3.0～11.0)內(nèi),酶具有活性,最適宜反應(yīng)pH在7.0～9.0之間；在pH8.0,以BApNA為底物的反應(yīng)體系中,酶在較廣泛的溫度范圍(4-80℃)內(nèi)具有活性,反應(yīng)

3、最適宜溫度為30℃～50℃。Mg2+、Ca2+(0～0.5 mmol／L)對(duì)胰蛋白酶有一定的激活作用。Fe3+、Cu2+、Zn2+、丙三醇和丙酮對(duì)胰蛋白酶有一定的抑制作用。Mn2+、乙醇和二甲基亞砜在低濃度時(shí)對(duì)酶起激活作用,高濃度下表現(xiàn)為抑制作用。
　　 建立兔機(jī)械創(chuàng)傷模型,以提取的粗酶、純化酶、木瓜蛋白酶和生理鹽水分別涂抹傷口,以肉眼觀察和傷口愈合面積為指標(biāo)對(duì)比各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示,粗酶和純化酶都有很好的效果,粗酶更佳。

4、r>　　 分別采用番瀉葉、大黃、5-羥色胺(5-HT)建立小鼠腹瀉模型1h后,以生理鹽水為陰性對(duì)照,思密達(dá)為陽(yáng)性對(duì)照,分別灌胃不同劑量(20mg.kg-1和40mg.kg-1)的南極磷蝦蛋白酶制劑,統(tǒng)計(jì)6h內(nèi)小鼠腹瀉發(fā)生率和腹瀉累積次數(shù)。結(jié)果顯示,南極磷蝦蛋白酶可顯著降低番瀉葉引起的小鼠腹瀉次數(shù),降低大黃,5-羥色胺引起的小鼠腹瀉次數(shù)。
　　 采用右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型,以生理鹽水為陰性對(duì)照

5、,柳氮磺胺吡啶為陽(yáng)性對(duì)照,分別灌胃不同劑量(20mg.kg-1和40mg.kg-1)的南極磷蝦蛋白酶制劑,通過(guò)肉眼及實(shí)體觀察,EGF的測(cè)定,組織切片觀察對(duì)比各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示:灌胃南極磷蝦蛋白酶的小鼠在飲用DSS誘導(dǎo)UC后,能夠保持良好的精神狀態(tài),少有便血現(xiàn)象,并能抑制小鼠體重的減輕；同時(shí),南極磷蝦蛋白酶能夠明顯提高UC小鼠血液中EGF表達(dá)水平,從組織切片結(jié)果來(lái)看,南極磷蝦蛋白酶也能降低潰瘍癥狀的發(fā)生,其作用效果在一定程度上與其濃度