南極磷蝦胰蛋白酶表達(dá)載體構(gòu)建與高效表達(dá).pdf

1、南極磷蝦屬節(jié)肢動物門甲殼綱磷蝦目，這種無脊椎動物是南極海域的關(guān)鍵物種，主要圍繞極地分布并集中于南冰洋，為多細(xì)胞生物中生物質(zhì)能最大、適應(yīng)環(huán)境最成功的動物物種之一。
　　特殊寒冷的生活環(huán)境造就了南極磷蝦體內(nèi)很多活性物質(zhì)都具有較高的研究價(jià)值，其中以胰蛋白酶的低溫高效性較為突出。南極磷蝦胰蛋白酶已經(jīng)在清除機(jī)體壞死組織、治療角膜堿燒傷以及清除牙斑等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并且成為輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥等學(xué)科的研究熱點(diǎn)。
　　由于磷蝦樣品

2、提取胰蛋白酶的現(xiàn)實(shí)困難和相對高昂的成本，本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)將南極磷蝦胰蛋白酶基因轉(zhuǎn)入工程菌中，利用基因工程技術(shù)表達(dá)目的蛋白并初步純化，為南極磷蝦胰蛋白酶的研究提供更加深入的資料和依據(jù)。
　　研究內(nèi)容:
　　(1)以南極磷蝦mRNA為模板，通過分析南極磷蝦胰蛋白酶基因，設(shè)計(jì)基因特異性引物，逆轉(zhuǎn)錄得到南極磷蝦胰蛋白酶cDNA。
　　(2)構(gòu)建pGEX-2T-TRY（TRY代表南極磷蝦胰蛋白酶）原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)

3、胞，并經(jīng)PCR、雙酶切及測序進(jìn)行鑒定。
　　(3)將pGEX-2T-TRY轉(zhuǎn)化入工程菌E.coli BL21，優(yōu)化表達(dá)條件，以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。
　　(4)工程菌經(jīng)超聲裂解，獲得目的蛋白。檢測目的蛋白的酶解活性并對目的蛋白初步純化。
　　研究結(jié)果:
　　(1)利用TAIL-PCR技術(shù)獲得基因序列，經(jīng)分析比對確認(rèn)為南極磷蝦胰蛋白酶基因，設(shè)計(jì)基因特異性引物，以南極磷蝦RNA為模板成功逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。
　　(

4、2)構(gòu)建的pGEX-2T-TRY原核表達(dá)載體，經(jīng)PCR和雙酶切以及測序鑒定證明已構(gòu)建成功。
　　(3)工程菌E.coli BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，成功表達(dá)出融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)在55KDa處有明顯的目的蛋白條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致。
　　(4)選用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠來純化帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白，初步純化出目的蛋白，但是尚未發(fā)現(xiàn)該蛋白具有酶活性。
　　研究結(jié)論]
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了原核