人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性及誘導(dǎo)分化研究.pdf

1、目的：
　　通過對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的干細(xì)胞特性和多向分化潛能的相關(guān)研究，揭示膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性；進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化的條件及可能的機(jī)制；進(jìn)一步展望誘導(dǎo)分化方法作為一種新穎的腦膠質(zhì)瘤治療方法的臨床應(yīng)用前景。
　　方法：
　　常規(guī)傳代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251,并將U251細(xì)胞傳代培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，用4％多聚甲醛固定U251細(xì)胞，并檢測U2

2、51中干細(xì)胞標(biāo)志物Sall4、NCAM、Oct4、Sox2、Nestin、和S100β表達(dá)情況，熒光顯微鏡下觀察U251細(xì)胞上述標(biāo)志物的表達(dá)情況。將貼壁生長的U251細(xì)胞分別經(jīng)成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有2μmol/L胰島素、500μmol/L（IBMX）、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛)和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含有100mmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉及0.05mmol/L維生素C）誘導(dǎo)分化后，分別

3、用油紅O染色方法檢測細(xì)胞中脂滴形成情況，茜素紅染色檢測細(xì)胞中鈣結(jié)節(jié)形成情況。CCK8法檢測經(jīng)誘導(dǎo)分化后U251細(xì)胞生長曲線。免疫蛋白印跡法分別測定脂肪細(xì)胞和成骨特異性蛋白表達(dá)以及誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞自噬和凋亡蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.多種干細(xì)胞標(biāo)志物均在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中穩(wěn)定表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示在U251中神經(jīng)細(xì)胞黏附分子NCAM、神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物S100β，多能干細(xì)胞標(biāo)記物

4、Sall4、Oct4及神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物Sox2均能夠穩(wěn)定表達(dá)。
　　2.U251細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后可以向脂肪細(xì)胞分化。在貼壁生長的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中加入成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基后，經(jīng)過誘導(dǎo)不同的時間梯度，油紅O染色發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中出現(xiàn)脂滴，并且隨著誘導(dǎo)的時間越長，脂滴數(shù)量增多并融合增大，且細(xì)胞增殖速度減慢，這點(diǎn)由CCK8實(shí)驗結(jié)果得以證實(shí)。通過免疫蛋白印跡實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中脂肪細(xì)胞相關(guān)特異性蛋白表達(dá)增加。
　　3

5、.U251細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可以向成骨細(xì)胞分化。在貼壁生長的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基后，經(jīng)過誘導(dǎo)不同的時間梯度，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中出現(xiàn)大量鈣結(jié)節(jié)，并且隨著誘導(dǎo)時間的延長，鈣結(jié)節(jié)增多。CCK8實(shí)驗結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)分化后腫瘤細(xì)胞增殖減慢；免疫蛋白印跡實(shí)驗結(jié)果顯示成骨細(xì)胞相關(guān)特異性蛋白表達(dá)增多，并且隨著誘導(dǎo)時間的延長細(xì)胞凋亡、自噬及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)也增加。
　　結(jié)論：
　　1.人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251具有干細(xì)胞特性和多向誘