利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建補(bǔ)體Ⅲ基因缺陷豬模型.pdf

1、C3是補(bǔ)體經(jīng)典途徑、旁路途徑以及甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)途徑三者的交匯點(diǎn)，是宿主防御機(jī)制中占據(jù)核心地位的特殊分子，近年來受到廣泛關(guān)注。研究者采用C3基因敲除小鼠作為模式工具，對(duì)C3參與炎癥反應(yīng)、免疫防御、免疫調(diào)控等方面進(jìn)行深入探究，發(fā)現(xiàn)C3不僅與自身免疫病、腎小球腎炎等疾病發(fā)展密切相關(guān)，C3基因缺陷還可延長皮膚移植存活率，這說明C3對(duì)異種移植研究也有著重要意義。然而，由于嚙齒類動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)與人之間存在重要差異，人類補(bǔ)體缺陷的病征不可

2、能在小鼠身上完全重現(xiàn)。而豬作為模型動(dòng)物，其各項(xiàng)生理指標(biāo)及內(nèi)部器官組織結(jié)構(gòu)都比嚙齒類動(dòng)物和人類更相近，尤其免疫系統(tǒng)與人類極其相近。故本研究利用基因組編輯技術(shù)-規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)介導(dǎo)C3基因的敲除，并結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)制備了國際首批C3基因缺陷巴馬香豬模型，培育出補(bǔ)體系統(tǒng)缺陷的基因敲除豬

3、模型，為進(jìn)一步探究C3對(duì)疾病發(fā)生機(jī)理、免疫缺陷帶來的影響提供更好的實(shí)驗(yàn)材料。
　　本論文采用CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)，在巴馬香豬C3基因第26個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)sgRNA進(jìn)行打靶，將設(shè)計(jì)好的C3-Cas9質(zhì)粒與表達(dá)紅色熒光的tdTomato質(zhì)粒共同核轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞，使用G418篩選出表達(dá)抗性的細(xì)胞，并通過測序篩選出基因敲除的細(xì)胞，利用體細(xì)胞核移植(S CNT)技術(shù)，構(gòu)建國際上首例C3基因敲除的克隆豬。然后對(duì)C3基因敲除豬進(jìn)行基

4、因型鑒定。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明挑取細(xì)胞克隆46個(gè)，經(jīng)PCR產(chǎn)物測序，39個(gè)克隆發(fā)生基因突變，C3基因突變效率為84.7％;其中雙等位基因敲除細(xì)胞克隆有21個(gè)，雙等位基因敲除效率為45.7％。從中選擇3到4個(gè)C3基因有效雙等位基因敲除的細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞核移植至六頭受體豬，一頭流產(chǎn)，四頭返情，一頭妊娠至終期，產(chǎn)仔豬6頭。第二批移植三頭受體豬，2頭妊娠至終期，產(chǎn)仔豬13頭。
　　綜上所述，本研究驗(yàn)證了CRISPR/Cas9系