持續(xù)異丙腎上腺素(ISO)輸注對(duì)膿毒癥早期大鼠心肌和心肌線粒體的保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò)觀察持續(xù)靜脈輸注不同劑量ISO對(duì)膿毒癥大鼠血清生化指標(biāo)、心肌病理改變、線粒體結(jié)構(gòu)和功能、炎癥因子和氧化應(yīng)激因子的影響，探討ISO對(duì)膿毒癥大鼠心臟的保護(hù)作用及其機(jī)制，并找出ISO的適宜劑量。本研究將為ISO在臨床上應(yīng)用于膿毒癥的早期保護(hù)性治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.建立膿毒癥模型及分組
　　無(wú)特定病原體(Specific pathogen Free，SPF)級(jí)SD雄性大鼠30

2、只（中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供:動(dòng)物批號(hào)44008500003278），體質(zhì)量250～300g，行右頸外靜脈置管術(shù)前禁食12h，自由飲水。
　　1.1 建立膿毒癥模型實(shí)驗(yàn)前24 h，所有實(shí)驗(yàn)大鼠行右頸外靜脈置管術(shù)建立靜脈輸液和采血通道。術(shù)后24 h，予實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射10mg/kg脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或10mg/kg生理鹽水建立膿毒癥模型或?qū)φ战M。
　　1.2 動(dòng)物分組采用簡(jiǎn)單隨機(jī)方法，將

3、30只大鼠編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組6只。內(nèi)毒素組:腹腔注射LPS10mg/kg同時(shí)持續(xù)輸注生理鹽水1ml/h;ISO干預(yù)組（低劑量組、中劑量組和高劑量組）腹腔注射LPS10mg/kg同時(shí)持續(xù)輸注ISO0.06μg/(kg·min)、0.3μg/(kg·min)和0.6μg/(kg·min);對(duì)照組腹腔注射生理鹽水10mg/kg同時(shí)持續(xù)輸注與其他組等體積(1ml/h)的生理鹽水。
　　1.3 觀察終點(diǎn)腹腔注射生理鹽水或L

4、PS后24 h。
　　2.檢測(cè)標(biāo)本的采集、制備和檢測(cè)
　　2.1 血液標(biāo)本的采集、制備和檢測(cè)
　　腹腔注射LPS或鹽水后2h、6h通過(guò)靜脈通道采血1ml并回輸?shù)攘葵}水，于觀察終點(diǎn)（腹腔注射LPS或生理鹽水后24 h）采血4ml。血液標(biāo)本室溫靜置1-2 h，3000rpm（離心外徑150mm）離心10min分離得到血清，將分離得到的血清分裝并放至-80℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè)。運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)腹腔注射LPS或鹽水后24 h

5、大鼠血清的肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平;運(yùn)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA法）檢測(cè)腹腔注射LPS或生理鹽水后2h、6h和24 h大鼠血清的TNF-α、IL-1β和IL-10水平。
　　2.2 心肌組織的采集、制備和檢測(cè)
　　于觀察終點(diǎn)（腹腔注射LPS或生理鹽水后24 h）用10％(100g/L)水合氯醛麻醉大鼠，打開(kāi)腹腔，迅速摘取心臟，在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗、去除血液和大血管。取100mg心肌

6、組織，采用差速離心法提取大鼠心肌線粒體，JC-1染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌線粒體腫脹度和膜電位。
　　取一小塊心肌組織(1cm3)切成1mm3大小，置于2.5％戊二醛固定、鋨酸后固定、脫水、包埋、切片、染色后透射電鏡下觀察并拍攝照片，觀察心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)。
　　另取一小塊心肌組織用10％甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木素-伊紅染色(HE染色)、透明處理封片后，光鏡下觀察心肌病理改變。
　　剩余組織分裝至E

7、P管并投入液氮中，隔日取出存放于-80℃冰箱以備測(cè)心肌線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。運(yùn)用比色法檢測(cè)大鼠心肌線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（SOD、iNOS活力及MDA、NO含量）。
　　3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　所有數(shù)據(jù)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。多樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA);均數(shù)兩兩比較時(shí)，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett T3法。P＜0.05

8、為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠24 h血清生化指標(biāo)(CK和CK-MB)
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組腹腔注射LPS后24 h大鼠血清的CK和CK-MB水平升高(P均＜0.05); ISO干預(yù)使CK和CK-MB水平降低（P均＜0.05）。
　　2、心肌線粒體氧化應(yīng)激因子水平
　　2.1 NO含量變化
　　與對(duì)照組相比，腹腔注射LPS后24 h內(nèi)毒素組心肌線粒體NO含量升高（8.300±0.

9、740&10.823±2.240，P＜0.05）;與內(nèi)毒素組相比，ISO干預(yù)使NO含量降低（P均＜0.05）。
　　2.2 iNOS活力變化
　　與對(duì)照組相比，腹腔注射LPS后24 h內(nèi)毒素組心肌線粒體iNOS活力升高（0.031±0.008&0.045±0.008，P＜0.05）;與內(nèi)毒素組相比，低劑量組iNOS活力降低（0.045±0.008&0.033±0.003，P＜0.05）;與內(nèi)毒素組和低劑量組相比，中、高劑量組

10、iNOS活力升高（P均＜0.05）。
　　2.3 SOD活力變化
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組腹腔注射LPS后24 h心肌線粒SOD活力降低（11.543±1.080&9.892±0.815，P＜0.05）;與內(nèi)毒素組相比，ISO干預(yù)使SOD活力升高（P均＜0.05）;與低劑量組相比，中、高劑量組SOD活力升高(11.822±0.460&19.802±1.309，11.822±0.460&19.737±1.215，P均＜0.0

11、5)。
　　3、線粒體腫脹度和膜電位水平
　　3.1 線粒體腫脹度
　　與內(nèi)毒素組（1.690±0.148）相比，ISO干預(yù)使線粒體腫脹度降低(P均＜0.05);與對(duì)照組（1.537±0.109）和低劑量組（1.506±0.116）相比，中劑量組腫脹度降低（1.160±0.186）（P均＜0.05）;與中劑量組相比，高劑量組腫脹度升高(1.160±0.186&1.393±0.128，P＜0.05)。
　　3.2

12、線粒體膜電位
　　與對(duì)照組（0.825±0.058）相比，內(nèi)毒素組（0.190±0.074）、低劑量組（0.175±0.05）、中劑量（0.198±0.086）、高劑量組（0.251±0.10）膜電位降低(P＜0.05)。
　　4、線粒體超微結(jié)構(gòu)
　　對(duì)照組線粒體大小正常，排列整齊。內(nèi)毒素組線粒體異常，表現(xiàn)為腫脹、大小不一，出現(xiàn)線粒體嵴斷裂、膜融合、空泡變性等改變。低、中劑量組線粒體結(jié)構(gòu)相比內(nèi)毒素組明顯改善，高劑量組線

13、粒體出現(xiàn)腫脹、嵴斷裂等異常。
　　5、心肌病理改變(HE染色)
　　對(duì)照組心肌排列整齊，未見(jiàn)異常。內(nèi)毒素組心肌組織疏松水腫，內(nèi)見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出，提示炎癥反應(yīng);低、中劑量組心肌炎癥反應(yīng)較內(nèi)毒素組減輕;高劑量組見(jiàn)炎癥滲出。
　　6、大鼠炎癥反應(yīng)指標(biāo)
　　6.1 不同時(shí)間點(diǎn)(2h、6h和24 h)各組大鼠血清TNF-α水平
　　6.1.1 腹腔注射LPS或鹽水后2h血清TNF-α水平
　　與對(duì)照組

14、相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑量和高劑量組）TNF-α水平顯著升高（P均＜0.05）;與內(nèi)毒素組相比，中劑量和高劑量組TNF-α水平顯著降低（P均＜0.05）;與低劑量組相比，中劑量和高劑量組TNF-α水平顯著降低（P均＜0.05）。
　　6.1.2 腹腔注射LPS或鹽水后6h血清TNF-α水平
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑量和高劑量組）TNF-α水平顯著升高(P＜0.05);與內(nèi)毒素組

15、相比，中劑量和高劑量組TNF-α水平顯著降低(P＜0.05);與低劑量組相比，高劑量組TNF-α水平顯著降低(P＜0.05)。
　　6.2 不同時(shí)間點(diǎn)(2h、6h和24 h)各組大鼠血清IL-1β水平
　　6.2.1 腹腔注射LPS或鹽水后2h血清IL-1β水平
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑量和高劑量組）IL-1β水平顯著升高（P均＜0.05）。
　　6.2.2 腹腔注射LPS或鹽水后6

16、h血清IL-1β水平
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑量和高劑量組）IL-1β水平顯著升高（P均＜0.05）。
　　6.2.3 腹腔注射LPS或鹽水后24h血清IL-1β水平
　　與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組和ISO處理組（低劑量、中劑量和高劑量組）IL-1β水平顯著升高(P＜0.05)。
　　6.3 不同時(shí)間點(diǎn)（2 h、6h和24 h）各組大鼠血清IL-10水平
　　6.3.1 腹腔注射L

17、PS或鹽水后2h血清IL-10水平
　　對(duì)照組IL-10水平未檢測(cè)到。與低劑量組相比，高劑量組IL-10水平顯著降低(P＜0.05)。
　　6.3.2 腹腔注射LPS或鹽水后6h血清IL-10水平
　　對(duì)照組IL-10水平未檢測(cè)到。與內(nèi)毒素組相比，低劑量組IL-10水平顯著升高(P＜0.05);與低劑量組相比，中劑量組IL-10水平顯著降低（P＜0.05）。
　　6.3.3 腹腔注射LPS或鹽水后24 h血清IL

18、-10水平
　　對(duì)照組IL-10水平未檢測(cè)到。與內(nèi)毒素組相比，低劑量組IL-10水平顯著升高(P＜0.05)，高劑量組IL-10水平顯著降低(P＜0.05);與低劑量組相比，中劑量組和高劑量組IL-10水平顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、膿毒癥早期大鼠心肌和心肌線粒體受損;
　　2、持續(xù)低劑量[0.06μg/(kg·min)]ISO輸注對(duì)心肌和心肌線粒體具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低氧化/氮化應(yīng)激