電針介導(dǎo)eNOS促局灶腦缺血-再灌注大鼠內(nèi)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞動員的機制研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察大鼠局灶腦缺血/再灌注后骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）能否動員至外周血進而歸巢到缺血腦區(qū)；
　　2.探究電針能否上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血中VEGFR2+EPCs、CD34+EPCs數(shù)量；
　　3.探究電針能否促進局灶腦缺血/再灌注大鼠缺血大腦皮質(zhì)區(qū)的血管再生；
　　4.探究電針可否通過介導(dǎo)eNOS促局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓VEGFR2+EPCs、CD34+EPCs動員至外周血；

2、r>　　5.探究電針可否通過介導(dǎo)eNOS促局灶腦缺血/再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)的血管再生。
　　方法：
　　采用線栓法制備局灶腦缺血/再灌注SD大鼠模型。90只SD雄性大鼠完全隨機分為模型+生理鹽水組、模型+DIL-acLDL組。熒光共聚焦技術(shù)于骨髓腔內(nèi)注射DIL-acLDL后的1d觀察骨髓內(nèi)細(xì)胞攝取DIL-acLDL的情況；1d、2d、3d、7d觀察骨髓、外周血CD34+DIL-acLDL+雙陽性細(xì)胞及缺血大腦皮質(zhì)區(qū)DIL

3、-acLDL+陽性細(xì)胞表達情況。160只SD雄性大鼠隨機分為正常組（N組）、假手術(shù)組（S組）、模型組（I/R組）、模型+電針組（I/RE組）、模型+電針+L-NAME組（I/REL組）。除N組外的各組局灶腦缺血1.5h后分為再灌注1d、2d、3d、7d四個亞組，每個亞組10只大鼠。選擇“百會”穴（GV20）及左側(cè)“四關(guān)”穴（合谷LI4/太沖LR3）為針刺穴位，刺激時間為20min，每日1次。流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血及骨髓中CD34+EPCs

4、、VEGFR2+EPCs數(shù)量，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）測定外周血中eNOS蛋白的表達,熒光定量PCR技術(shù)檢測缺血大腦皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA的表達，免疫組織化學(xué)法檢測缺血大腦皮質(zhì)區(qū)VEGFR2蛋白表達及CD34標(biāo)記的微血管計數(shù)，免疫組織化學(xué)法檢測缺血大腦皮質(zhì)eNOS蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.生理鹽水組熒光共聚焦結(jié)果為陰性，DIL-acLDL組1d后骨髓腔內(nèi)觀察到紅色標(biāo)記的DIL-acLDL+細(xì)胞，并分別于1

5、d、2d、3d、7d后在骨髓及外周血中觀察到CD34+DIL-acLDL+雙陽性細(xì)胞，在缺血大腦皮質(zhì)區(qū)未檢測到DIL-acLDL+細(xì)胞。
　　2.大鼠骨髓CD34+EPCs、VEGFR2+EPCs數(shù)量變化情況
　　大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d、3d I/R組骨髓內(nèi)CD34+EPCs數(shù)量逐漸減少，但均明顯高于S組（P＜0.01）,I/RE組在各時間點與I/R組比較均顯著增高（P＜0.01）, eNOS抑制后骨髓內(nèi)CD

6、34+EPCs數(shù)量相比I/RE組則顯著降低（P＜0.01）。大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d I/R組骨髓VEGFR2+EPCs數(shù)量明顯高于N組（P＜0.01）,7d時與N組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），I/RE組在各時間點與I/R組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05），而I/REL組的VEGFR2+EPCs數(shù)量相比I/RE組則顯著降低（P＜0.01）。
　　3.大鼠外周血CD34+EPCs、VEGFR2+

7、EPCs數(shù)量變化情況
　　大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d、3d I/R組外周血CD34+EPCs數(shù)量明顯高于S組（P＜0.01），I/RE組在各時間點與I/R組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），而I/REL組的CD34+EPCs數(shù)量相比I/RE組則顯著降低（P＜0.01）。大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d I/R組外周血VEGFR2+EPCs數(shù)量明顯高于N組（P＜0.01）,7d時與N組相比仍有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0

8、.05），I/RE組在各時間點與I/R組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05），而I/REL組的VEGFR2+EPCs數(shù)量相比I/RE組則顯著降低（P＜0.01）。
　　4.外周血eNOS的蛋白表達情況
　　大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后I/R組1d、2d、3d外周血eNOS蛋白表達量明顯高于S組（P＜0.01）；I/RE組在各時間點與I/R組相比增高均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；而I/REL組的eNOS蛋白表

9、達量相比I/RE組則顯著降低（P＜0.01）。
　　5.大鼠局灶腦缺血皮質(zhì)區(qū)CD34微血管計數(shù)
　　與I/R組比較，I/RE組各時間點CD34微血管計數(shù)均顯著增多（P＜0.01），在eNOS被抑制后電針促腦內(nèi)血管再生的作用顯著降低（P＜0.01）。
　　6.大鼠局灶腦缺血皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA表達及VEGFR2+細(xì)胞表達情況
　　大腦缺血皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA的表達量及VEGFR2+細(xì)胞表達均隨著缺血

10、時間的推移逐漸增高，與N組比較，I/R組各時間點VEGFR2+細(xì)胞表達均增高（ P＜0.01）；I/RE組各時間點VEGFR2 mRNA的表達量及VEGFR2+細(xì)胞表達較I/R組均明顯增高（P＜0.01）；當(dāng)eNOS被阻斷后，電針促VEGFR2 mRNA及VEGFR2+細(xì)胞表達作用則明顯降低（P＜0.01）。
　　7.缺血大腦皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白表達情況
　　大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d、3d缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS+細(xì)胞

11、數(shù)量量明顯高于S組（P＜0.01）；I/RE組在各時間點與I/R組相比增高均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；而I/REL組的eNOS+細(xì)胞數(shù)量相比I/RE組則顯著降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1. DIL-acLDL可標(biāo)記活體大鼠骨髓腔內(nèi)細(xì)胞，且骨髓腔內(nèi)EPCs可動員至外周血；
　　2.電針可動員局灶腦缺血/再灌注大鼠內(nèi)源性EPCs促大鼠缺血腦區(qū)血管再生，該作用在eNOS被抑制后減弱，推測電針動員EPCs促血