血吸蟲(chóng)感染鼠樹(shù)突狀細(xì)胞抑制過(guò)敏性哮喘的機(jī)制.pdf

1、目的：研究日本血吸蟲(chóng)（SJ）感染鼠樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）在抑制過(guò)敏性哮喘中的作用機(jī)制。
　　方法：第一部分，利用過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究SJ感染鼠DC亞型在抑制過(guò)敏性哮喘疾病中的作用，我們用CD8α+磁珠和CD11c+磁珠分離純化SJ感染鼠、SEA致敏鼠及正常鼠DC亞群CD8α+CD11c+及CD8α-CD11c+細(xì)胞，一部分用于qRT-PCR檢測(cè)各DC亞型分泌細(xì)胞因子的表達(dá)，另一部分通過(guò)尾靜脈過(guò)繼轉(zhuǎn)移給正常小鼠（5×105 DC/只），1

2、h后誘發(fā)哮喘。4周后取小鼠肺組織作病理切片，觀察其炎癥變化。收集小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)的上清液、肺泡灌洗液、血清，用于檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4、 IL-5、IL-10、IL-12、TGF-β及OVA特異性IgE水平；第二部分，探討SEA刺激后DC在誘導(dǎo)CD4+T分化方向改變中的作用。我們?cè)隗w外培養(yǎng)骨髓DC，并用可溶性蟲(chóng)卵抗原（SEA）刺激18h，以LPS刺激作為陽(yáng)性對(duì)照，以Medium刺激作為陰性對(duì)照。流式細(xì)胞術(shù)（FACS）、免疫組化和qRT-PC

3、R檢測(cè)刺激后DC表面標(biāo)志和分泌細(xì)胞因子的變化。將刺激后的DC與OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠脾臟中的CD4+T共培養(yǎng)48h、72h后用qRT-PCR的方法檢測(cè)CD4+T分泌細(xì)胞因子的變化；第三部分，從支氣管粘液分泌的角度探討SJ感染小鼠抑制過(guò)敏性哮喘的機(jī)制。我們用SJ感染小鼠以及過(guò)繼轉(zhuǎn)移SEA致敏鼠DC亞型并誘發(fā)哮喘后取小鼠肺臟做HE和PAS染色并檢測(cè)肺部MUC5ACmRNA表達(dá)情況，觀察炎癥和黏液分泌的變化。利用qRT-PCR檢測(cè)肺部IL-13m

4、RNA表達(dá)的變化，用IHC觀察小鼠肺部IL-13和CD4+T的表達(dá)位置。體外培養(yǎng)骨髓DC并用SEA刺激后qRT-PCR檢測(cè)IL-13mRNA的變化，將DC與CD4+T共培養(yǎng)48h和72h分別后用qRT-PCR檢測(cè)CD4+T表達(dá)IL-13mRNA的變化。
　　結(jié)果：第一部分，qRT-PCR法檢測(cè)顯示 CD8α-DC與CD8α+DC相比無(wú)論是感染組還是正常組CD11b mRNA水平均明顯降低（P＜0.05），SJCD8α-DC組的CD

5、80mRNA、CD86mRNA水平相對(duì)于SJCD8α+DC明顯下降（P＜0.05），而IL-10mRNA水平明顯升高（P＜0.05），TGF-βmRNA（P＜0.001）和IL-12 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。肺部病理學(xué)結(jié)果顯示過(guò)繼轉(zhuǎn)移SJ/SEA小鼠CD8α-DC與其他組相比炎癥明顯減輕（P＜0.05）。ELISA檢測(cè)血清中OVA特異性IgE結(jié)果顯示過(guò)繼轉(zhuǎn)移SJ/SEA小鼠CD8α-DC組與其他組相比明顯下降（P＜0.05），

6、檢測(cè)過(guò)繼轉(zhuǎn)移SJ/SEA小鼠CD8α-DC組的BALF和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-5水平明顯升高（P＜0.05），而IL-10、TGF-β水平明顯升高（P＜0.05）。第二部分，F(xiàn)ASC檢測(cè)SEA刺激后DC與LPS刺激后DC相比，表面標(biāo)志CD80、CD86、CD40表達(dá)下降。IHC檢測(cè)結(jié)果顯示SEADC與LPSDC相比，CD11c表達(dá)率降低。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示SEADC與LPSDC相比，表面標(biāo)志CD80mRNA（P＜0.

7、05）、CD86mRNA表達(dá)下降（P＜0.05），SEADC與MediumDC相比細(xì)胞因子IL-1βmRNA（P＜0.05）、IL-10 mRNA（P＜0.05）、IL-12 mRNA（P＜0.05）、IL-6 mRNA（P＜0.05）、IL-23 mRNA（P＜0.05）表達(dá)升高，TGF-βmRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異。SEADC誘導(dǎo)OVA CD4+T與MediumDC相比表達(dá)IFN-γmRNA量降低（P＜0.05），IL-4mRNA表達(dá)

8、升高（P＜0.05），IL-10mRNA表達(dá)升高（P＜0.05），IL-17mRNA表達(dá)量低（P＜0.05）。第三部分，SJ感染小鼠并誘發(fā)哮喘后肺部病理HE和PAS染色結(jié)果結(jié)果顯示SJ+OVA組小鼠與OVA組相比支氣管粘液分泌減輕，肺部MUC5AC表達(dá)減弱（P＜0.01）。肺部IHC結(jié)果顯示SJ+OVA組小鼠與OVA組相比IL-13表達(dá)區(qū)域減少，并且通過(guò)與CD4合染發(fā)現(xiàn)IL-13主要由CD4+T分泌。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示SJ+OV

9、A組小鼠肺部IL-13mRNA與OVA組相比明顯下降（P＜0.05），ELISA檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-13表達(dá)下降（P＜0.05）。過(guò)繼轉(zhuǎn)移SJ感染鼠DC到正常小鼠并誘發(fā)哮喘后發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-13與過(guò)繼轉(zhuǎn)移正常小鼠DC并誘發(fā)哮喘組小鼠相比表達(dá)下降（P＜0.05）。體外培養(yǎng)骨髓DC細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示SEADC與LPSDC相比，IL-13mRNA表達(dá)下降（P＜0.05）。將DC與CD4+T共培養(yǎng)，qRT-PC