東亞鉗蝎蝎毒rAGAP對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。盡管目前已有多種HCC治療方式應(yīng)用于臨床，但由于存在的副作用，遠(yuǎn)達(dá)不到人們的預(yù)期效果。中藥(traditional chinese medicine，TCM)在中國(guó)傳統(tǒng)治療中發(fā)揮了巨大作用，由于其存在治療HCC的潛力，因而吸引了研究者們的注意。眾多研究證實(shí)，TCM可以通過(guò)多種作用方式延緩腫瘤過(guò)程，改善

2、HCC患者的生存質(zhì)量。
　　東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤多肽(Buthus martensii Karsch Analgesic-antitumoralpeptide，BmK AGAP)是從蝎毒多肽中分離出來(lái)的一種毒素。Bmk AGAP不僅具有鎮(zhèn)痛作用，還可以抑制多種惡性腫瘤的增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此重組鎮(zhèn)痛抗腫瘤多肽(recombinant analgesic-antitumoral peptide，rAGAP)可能成為一種

3、新型的抗腫瘤藥物，應(yīng)用于臨床治療。我們?cè)诮AGAP高效原核表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)蛋白質(zhì)變復(fù)性和超濾截留技術(shù)，獲得高效的rAGAP蛋白，并通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，研究其對(duì)HCC生長(zhǎng)的抑制作用及具體機(jī)制。
　　方法：
　　1、通過(guò)構(gòu)建rAGAP基因工程載體，建立rAGAP高效原核表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)表達(dá)獲得包涵體。利用蛋白質(zhì)變復(fù)性技術(shù)，對(duì)獲得的包涵體洗滌、變性、復(fù)性，獲得高純度可溶性rAGAP蛋白。并利用超濾截留技術(shù)，對(duì)復(fù)性后蛋白進(jìn)行

4、濃縮、透析，制備得到高濃度、高活性的rAGAP蛋白。
　　2、在體外通過(guò)MTT觀察rAGAP對(duì)人肝癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用。通過(guò)流式細(xì)胞儀、Western-blot、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)rAGAP對(duì)人肝癌細(xì)胞周期的阻滯效應(yīng)。通過(guò)流式細(xì)胞儀、Hoechst33258染色、Western-blot、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)藥物對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。
　　3、在體內(nèi)觀察rAGAP對(duì)裸鼠肝癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，

5、并通過(guò)Western-blot、免疫組化、TUNEL檢測(cè)rAGAP對(duì)肝癌組織細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1、為了有效純化具有功能的rAGAP，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種His6標(biāo)記rAGAP(N-氨基末端His6標(biāo)記和C-羧基末端His6標(biāo)記）的重折疊方法。能量?jī)?yōu)化和分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果證實(shí)，N-氨基末端直接參與了rAGAP核心區(qū)域的構(gòu)成。此外，His6標(biāo)記的N-氨基末端能夠影響rAGAP整個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)，甚至能夠與rAGA

6、P疏水核心產(chǎn)生相互影響，這一結(jié)果被證實(shí)與rAGAP活性具有密切關(guān)系。此外，使用堿性His6標(biāo)記N-氨基末端能夠使其漂浮于蛋白質(zhì)表面，從而影響蛋白質(zhì)表面的電荷分布;而His6標(biāo)記的C-羧基末端，與蛋白質(zhì)融合的同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)分布沒(méi)有影響。
　　本研究制備方法得到的rAGAP產(chǎn)量為其他方法的4倍，反相高效液相色譜法分析，制備的rAGAP純度為95％。根據(jù)rAGAP同源模型分析發(fā)現(xiàn)，其可能屬于長(zhǎng)鏈毒素，主要通過(guò)干預(yù)Na+通道而發(fā)揮其生物學(xué)活

7、性。電生理結(jié)果證實(shí)rAGAP能夠顯著抑制70％的TTX-R鈉離子電流，而TTX-R鈉離子電流與痛覺(jué)信號(hào)、腫瘤轉(zhuǎn)導(dǎo)具有密切關(guān)系。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)
　　(1) MTT結(jié)果顯示rAGAP對(duì)多種人肝癌細(xì)胞株的增殖均具有顯著抑制作用，并呈濃度依賴性。并且rAGAP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞24h、48h、72h不同時(shí)間點(diǎn)的增殖也具有抑制作用，并具有時(shí)間依賴性。
　　(2)流式細(xì)胞儀、Westem-blot、qRT-PCR等檢測(cè)結(jié)果

8、顯示，rAGAP可以將人肝癌HepG2細(xì)胞周期阻滯在G1期，能夠上調(diào)p21、下調(diào)CDK2的蛋白表達(dá)水平，上調(diào)p53、下調(diào)CDK2、CyclinD1的mRNA表達(dá)水平。我們推測(cè)rAGAP可能是通過(guò)調(diào)控p21、p53、CDK2、CyclinD1等細(xì)胞周期相關(guān)基因發(fā)揮其阻滯細(xì)胞周期的作用。
　　(3)流式細(xì)胞儀、Hoechst33258染色、Western-blot、qRT-PCR等檢測(cè)結(jié)果顯示，rAGAP可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，并能

9、夠上調(diào)Bax、PARP，下調(diào)Bcl-2、survivin等凋亡基因的蛋白表達(dá);上調(diào)FADD、CRADD基因的mRNA表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)，rAGAP可以下調(diào)磷酸化ERK1/2和STAT3的蛋白水平，下調(diào)STAT3的mRNA水平，而他們是許多凋亡基因的上游基因，因此我們猜測(cè)，rAGAP可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、survivin、PARP、FADD、CRADD、ERK1/2和STAT3等基因發(fā)揮其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　3、體

10、內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　(1)通過(guò)對(duì)裸鼠肝癌皮下移植瘤的腫瘤體積及裸鼠體重分析顯示，rAGAP能夠顯著的抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤的增殖，并較5-FU組具有用藥劑量小的優(yōu)勢(shì)。
　　(2) Western-blot結(jié)果顯示，rAGAP高劑量組（2mg/kg）可以上調(diào)p53，下調(diào)Cyclin D1的蛋白表達(dá)，且對(duì)p53的結(jié)果優(yōu)于5-Fu組，因此我們推測(cè)，rAGAP在肝癌組織中可能通過(guò)調(diào)節(jié)p53及Cyclin D1發(fā)揮阻滯細(xì)胞周期的作用。

11、　　(3) TUNEL結(jié)果顯示，rAGAP組中凋亡細(xì)胞的數(shù)目明顯增加，rAGAP可以誘導(dǎo)肝癌組織發(fā)生凋亡。Western-blot結(jié)果證實(shí)，rAGAP低、高劑量組(1、2mg/kg)與模型組比較可以顯著上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2基因的蛋白表達(dá)水平，且藥物高劑量組對(duì)Bax調(diào)節(jié)的趨勢(shì)優(yōu)于5-Fu組。免疫組化結(jié)果顯示，rAGAP低、高劑量組(1、2mg/kg)與模型組比較，剪切的caspase3陽(yáng)性表達(dá)明顯增多。因此，我們推測(cè)，rAGAP可以