南蛇藤總萜調(diào)控CSN6蛋白抑制結(jié)直腸癌的作用及機(jī)制研究.pdf

1、引言
　　結(jié)直腸癌，發(fā)病率位于全世界常見(jiàn)惡性腫瘤的第3位，在消化道腫瘤中發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌。在中國(guó)上海地區(qū)，結(jié)直腸癌患病率在各癌癥中排列第3位，發(fā)病率為23.5/10萬(wàn)，而死亡率為11.8/10萬(wàn)。結(jié)直腸癌的臨床癥狀以腹瀉、便秘、腫塊、便血、貧血、腸梗阻為主，晚期多出現(xiàn)肝、肺和腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，西醫(yī)診斷主要通過(guò)直腸指診、x線(xiàn)造影、內(nèi)窺鏡檢查和病理檢驗(yàn)確定。約半數(shù)結(jié)直腸癌患者可生存5年左右。外科手術(shù)切除和放射治療是治療結(jié)直腸癌常用的

2、治療手段，但其單獨(dú)治療療效不佳，為了預(yù)防癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，減輕患者痛苦，提高生活質(zhì)量，越來(lái)越多的植物源化合物被用于抗癌的藥物治療和化學(xué)預(yù)防。Newman等統(tǒng)計(jì)在1981-2006年間，所有被批準(zhǔn)的抗癌藥物中，約73％的藥物是屬于天然產(chǎn)品藥物，或者是基于天然產(chǎn)品的系列藥物，天然藥物因其多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)和多途徑的抗腫瘤作用，日漸成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。
　　南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）為衛(wèi)矛科南

3、蛇藤屬落葉木質(zhì)藤本植物，其莖、根、葉和果均可入藥，現(xiàn)代工藝從南蛇藤葉、根皮、莖、葉、種子等部位分離到多種成分，主要有倍半萜、三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾體類(lèi)、鞣質(zhì)等，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等多種作用。其中，南蛇藤莖乙酸乙酯總萜(C.orbiculatus ethyl acetate extract，COE)的抗腫瘤作用已被廣泛證實(shí)，以往的研究多集中在對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成等方面，關(guān)于其在腫瘤細(xì)胞自噬與

4、凋亡方面的研究甚少。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)，COE可抑制人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡，同時(shí)發(fā)現(xiàn)COE可降低CSN6蛋白表達(dá)水平。CSN6屬于CSN的第六亞基，對(duì)于哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育非常重要，CSN6基因缺失或蛋白降解都會(huì)導(dǎo)致胚胎的死亡，從這些死亡的胚胎中可以發(fā)現(xiàn)p53及p21升高及細(xì)胞凋亡，在多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)CSN6過(guò)表達(dá)，其主要功能是調(diào)控蛋白質(zhì)泛素化過(guò)程中的泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzy

5、me，E3)活性而起作用，但是，CSN6對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡與自噬的調(diào)節(jié)作用還不很清楚，CSN6是否參與COE抑制結(jié)直腸癌的作用未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬研究CSN6分子是否參與調(diào)節(jié)COE誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞凋亡與自噬。
　　本課題共分為三部分研究?jī)?nèi)容。
　　第一部分:CSN6、Myc蛋白在人結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義
　　目的:檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中CSN6、Myc表達(dá)，分析CSN6和Myc兩者相關(guān)性，并分析其

6、在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的臨床意義。
　　方法:選擇2012年1月至2014年12月手術(shù)切除后并經(jīng)病理證實(shí)的結(jié)直腸癌患者48例，采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)CSN6、Myc蛋白在人結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)癌組織及癌旁腸組織中CSN6mRNA、Myc mRNA，用x2檢驗(yàn)或者Fisher確切概率法對(duì)資料進(jìn)行描述，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果

7、:免疫組織化學(xué):CSN6蛋白陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色，存在于結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞漿或胞核中，CSN6在結(jié)直腸癌中陽(yáng)性表達(dá)率為70.8％(34/48)，癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)率為10.4％(5/48);Myc在癌組織中的過(guò)表達(dá)率為83.3％，高于癌旁組織，差異有顯著性(P＜0.05); RT-PCR示，CSN6mRNA和Myc mRNA在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中均有不同程度的表達(dá)，約75％(36/48)癌組織中CSN6 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織，77

8、.09％(37/48)癌組織中MycmRNA表達(dá)水平高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001);二者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.652，p=0.041); CSN6 mRNA，Myc mRNA在Dukes C期+D期表達(dá)上調(diào)，與A期、B期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但A期與B期之間無(wú)顯著性差異;CSN6mRNA，Myc mRNA的表達(dá)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性與陰性組間有顯著性差異(p＜0.05)，但在性別、年齡、病灶位置、組織類(lèi)

9、型等組間表達(dá)無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論:(1)結(jié)直腸癌組織中CSN6mRNA、Myc mRNA的表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，二者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.652，p=0.041);(2)癌組織中CSN6、Myc蛋白表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　第二部分:南蛇藤總萜誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞凋亡與自噬的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:從細(xì)胞自噬及凋亡關(guān)系角度探討南蛇藤總萜(COE)抑制

10、人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。
　　方法:選用不同濃度的COE處理體外培養(yǎng)的結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞，MTT法檢查細(xì)胞存活率，電鏡(TEM)觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinⅤ，F(xiàn)ITC-PI雙染與PI單染法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期，免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)COE對(duì)細(xì)胞自噬及凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;為進(jìn)一步探討COE誘導(dǎo)的自噬對(duì)凋亡的影響，用自噬激動(dòng)劑Rapamycin和抑制劑3-MA聯(lián)合80 m

11、g/L COE干預(yù)HT-29細(xì)胞，用吖啶橙染色細(xì)胞，并采用MTT法檢測(cè)Rapamycin、3-MA調(diào)節(jié)自噬后，對(duì)COE抑制HT-29細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:COE抑制HT-29細(xì)胞的增殖，呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性，作用24h的IC50為149.65μg/mL。隨著COE濃度的升高，TEM示細(xì)胞中凋亡小體及自噬體明顯增多，細(xì)胞凋亡率也明顯高于對(duì)照組，并且COE誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞周期停滯于GOG1期，呈濃度依賴(lài)性;和COE治療組比較，C

12、OE聯(lián)合3-MA組的細(xì)胞生存率、AVO的數(shù)量顯著下降，免疫印跡分析，COE聯(lián)合3-MA組的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)也降低，相反，COE聯(lián)合Rapamycin組的AVO量增加、LC3-Ⅱ的表達(dá)上調(diào)，更重要的是，COE聯(lián)合Rapamycin組與COE聯(lián)合3-MA組比較，細(xì)胞生存率降低，這個(gè)結(jié)果表明，自噬可以促進(jìn)COE抑制人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:COE可誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡與自噬，并且自噬可以協(xié)同COE抑制人結(jié)直腸癌HT-

13、29細(xì)胞增殖。
　　第三部分:COE誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡及自噬的分子機(jī)制
　　目的:探討Akt-CSN6-Myc信號(hào)軸是否參與COE誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡與自噬.
　　方法:首先用Western blot方法檢測(cè)COE不同濃度組對(duì)CSN6蛋白及其下游基因相關(guān)蛋白Myc、P53表達(dá)的影響;接著研究CSN6對(duì)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖的影響，成功構(gòu)建了CSN6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了HT-29-MIGR1-CSN6細(xì)胞株，選用

14、80mg/L濃度的COE處理HT-29-MIGR1、HT-29-MIGR1-CSN6細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)CSN6-Myc信號(hào)軸相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生存率;并探討Akt激酶對(duì)CSN6-Myc信號(hào)軸的影響，成功構(gòu)建了Akt過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了HT-29-MIGR1-Akt細(xì)胞株，選用80mg/L濃度的COE處理Akt激酶過(guò)表達(dá)組（HT-29-MIGR1-CSN6細(xì)胞組）、Akt激酶抑制組（用PI

15、3K抑制劑LY294002同時(shí)干預(yù)，終濃度50μM）24h，Western blot檢測(cè)p-Akt、CSN6、Myc、p53等蛋白表達(dá)變化;最后探討了COE對(duì)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。
　　結(jié)果:隨著COE濃度的增加，CSN6、Myc蛋白表達(dá)水平逐漸下降，p53表達(dá)水平反而上升，40、80、160mg/L COE組與control組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CSN6 mRNA表達(dá)水平有一定的變

16、化，但與control組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，以上結(jié)果提示COE能夠下調(diào)CSN6蛋白的表達(dá)水平，但其蛋白質(zhì)水平的改變不是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中mRNA的水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的;相比control組，COE組、COE+HT-29-MIGR1組、COE+HT-29-MIGR1-CSN6組細(xì)胞生存率明顯下降，但是，COE+HT-29-MIGR1-CSN6組細(xì)胞生存率較COE組、COE+HT-29-MIGR1組，有所升高，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明， COE可

17、通過(guò)降低CSN6蛋白表達(dá)，來(lái)抑制HT-29細(xì)胞的增殖;與control組比較，Akt激酶過(guò)表達(dá)組的Akt、p-Akt蛋白表達(dá)增高，其下游基因CSN6、Myc的蛋白表達(dá)水平也明顯升高，p53蛋白表達(dá)下降，Akt激酶抑制組的Akt、p-Akt、CSN6、Myc蛋白表達(dá)結(jié)果與之相反，COE處理后，HT-29-MIGR1-Akt細(xì)胞組的p-Akt、CSN6、Myc蛋白表達(dá)明顯下降，p53蛋白表達(dá)升高，上述結(jié)果說(shuō)明，COE可抑制Akt磷酸化，從而

18、下調(diào)CSN6蛋白水平;同時(shí)，隨著COE濃度的增加，Akt-Thr308、mTOR-Ser2481、S6K-Thr389磷酸化水平逐漸下降，結(jié)果說(shuō)明COE可通過(guò)抑制Akt磷酸化水平，下調(diào)mTOR、S6K的激酶活性從而抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)， mTOR活性的降低也可促進(jìn)自噬的產(chǎn)生。
　　結(jié)論:COE通過(guò)影響Akt-CSN6-Myc信號(hào)軸誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞凋亡與自噬。另外，對(duì)PI3K-Akt-mTOR