大黃酚脂質(zhì)體對小鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、腦血管病是臨床多發(fā)病、常見病之一，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高致死率的特點(diǎn)，并有年輕化趨勢，影響患者的生活和工作，給社會和家庭帶來沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。在缺血性腦血管病的康復(fù)治療中，恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)是避免腦組織缺血損傷的首要條件，但與此同時帶來的再灌注損傷也是目前醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)。在腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中，有眾多病理機(jī)制參與其中，如興奮性氨基酸的過度釋放、體內(nèi)離子水平失衡、能量耗竭、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，這些因素相互作

2、用最終導(dǎo)致腦組織的不可逆損害。因此，近年來化學(xué)藥物如鈣離子拮抗劑，自由基清除劑，以及神經(jīng)保護(hù)劑等化學(xué)藥物用于治療腦缺血再灌注損傷。但是，用藥后出現(xiàn)的一系列不良反應(yīng)如抗藥性、胃腸道反應(yīng)，腦出血等超出了臨床長期治療所帶來的治療效果。近年來，臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)報道中藥成分在治療腦缺血再灌注損傷方面具有很大的優(yōu)勢。
　　大黃Radixet rhizoma Rhei為蓼科植物藥用大黃Rheum officinale Baill、掌葉大黃heum

3、 palmatum L、或唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim的干燥根及根莖，主產(chǎn)于四川、青海、甘肅等地。大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，苦寒，入脾、胃、大腸、心包、肝經(jīng)，主攻積滯，可清濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒之功能。現(xiàn)代藥理研究表明，大黃除具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的作用外，尚具有清除自由基、降血脂、抗動脈硬化、抗癌、延緩衰老等藥理作用。大黃的主要藥效成分是蒽醌類化合物，大黃酚(Chrysophanol，Chry

4、)屬羥基蒽醌類，具有抗病毒、抗癌、抗炎、抗菌、降壓和解痙等作用。
　　本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明大黃酚在體外可清除超氧自由基、DPPH自由基、羥基自由基，對離體大鼠肝、腦丙二醛(Malondiadehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)生成有明顯的抑制作用;在小鼠腦缺血再灌注損傷后，大黃酚改善學(xué)習(xí)記憶功能并提高耐缺氧的能力，改善腦組織病理形態(tài)學(xué)損傷，結(jié)果表明大黃酚具有腦保護(hù)作用，但大黃酚對

5、腦的保護(hù)作用機(jī)制尚不明確。
　　大黃酚屬于脂溶性化合物，在水中溶解度極小，見光易分解，性質(zhì)極其不穩(wěn)定，且對胃腸有刺激作用，且生物利用度不高，影響了藥物的臨床應(yīng)用。因此，本研究首先從中藥大黃中提取大黃酚粗品，再采用制備高效液相色譜法（PHPLC）進(jìn)行單體分離，再完成大黃酚脂質(zhì)體(Chrysophanolliposomes，Chr-lip)的制備，建立昆明種小鼠腦缺血再灌注模型，動態(tài)觀察小鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷評分，神經(jīng)元超微結(jié)

6、構(gòu)，病理組織學(xué)改變以及SOD，谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)，一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)的活性，MDA，一氧化碳(Nitricoxide，NO)含量，以及Bax，Bcl-2，Cytc，caspase3等表達(dá)變化。確定缺血后與氧化損傷及凋亡的關(guān)系，并選用大黃酚脂質(zhì)體進(jìn)行干預(yù)，評價干預(yù)后神經(jīng)功能缺損評分，以及大黃酚脂質(zhì)體對氧化應(yīng)激，自由基損傷，細(xì)胞凋亡

7、信號通路韻作用，初步探討其在缺血再灌注損傷后的腦保護(hù)作用機(jī)制。本研究分三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。
　　第一部分大黃酚的提取純化及大黃酚脂質(zhì)體制各
　　目的:建立從大黃中分離純化大黃酚的PHPLC方法，考察大黃酚脂質(zhì)體的處方和制備工藝進(jìn)行研究，并評價其質(zhì)量。
　　方法:建立HPLC測定大黃酚的分析方法，采用Hypersil BDS C8(4.6×150 mm，5μm)，流動相為0.1％磷酸-甲醇溶液(15∶85)，

8、流速為1.0mL·min-1，柱溫35℃，檢測波長254 nm;其次，建立從大黃提取液中分離純化大黃酚的PHPLC法，采用ZORBAXSB-C18:(21.2 mm×250 mm，7μm)，流動相:0.1％磷酸∶甲醇(15∶85)，柱溫:35℃，流速:20 mL·min-1，檢測波長:254 nm，進(jìn)樣量:7mL，餾分收集:基于峰，閾值Min:2.2。制備所得大黃酚單體采用核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，

9、NMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，HPLC法檢測其純度;再次，對大黃酚脂質(zhì)體的處方和制備工藝進(jìn)行研究，采用薄膜-超聲法制備大黃酚脂質(zhì)體，并考察大黃酚脂質(zhì)體的包封率、形態(tài)學(xué)、粒徑分布、穩(wěn)定性。
　　結(jié)果:
　　所得大黃酚單體經(jīng)NMR結(jié)構(gòu)鑒定為大黃酚，經(jīng)HPLC法檢測，其含量為98.9％。大黃酚脂質(zhì)體包封率為88.5％。粒徑較為均勻，相互之間無聚集現(xiàn)象，粒徑均小于2μm，穩(wěn)定性好。
　　小結(jié):
　　建立PHPLC分離純化大黃中大

10、黃酚方法，該方法靈敏度高，操作簡便，所得大黃酚單體含量為98.9％。大黃酚脂質(zhì)體包封率為88.5％，可用于藥理學(xué)研究。
　　第二部分大黃酚脂質(zhì)體對小鼠腦缺血再灌注損傷所致氧化應(yīng)激的影響
　　目的:動態(tài)觀察小鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷評分，神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，病理組織學(xué)改變以及SOD，GSH-PX，NOS的活性，MDA，NO含量。研究大黃酚脂質(zhì)體對腦缺血再灌注損傷所致氧化應(yīng)激的作用，探討大黃酚脂質(zhì)體抗氧化作用的相關(guān)機(jī)制。

11、　　方法:應(yīng)用線栓法建立小鼠腦缺血再灌注模型，采用健康雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量24～26 g。實(shí)驗(yàn)1:小鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、腦缺血再灌注組（腦缺血1h后再灌注，按再灌注不同時間點(diǎn)分為3h、6h、12h、24 h、48 h、72h6個亞組。實(shí)驗(yàn)2:小鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、腦缺血再灌注24 h組、大黃酚脂質(zhì)體(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)三個劑量組。大黃酚脂質(zhì)體組于腦缺血再灌注前3天連續(xù)腹腔給予大黃酚脂質(zhì)體

12、，每天一次。于規(guī)定時間檢測小鼠神經(jīng)功能損傷評分;采用HE法，透射電鏡法觀察小鼠腦組織病理組織學(xué)，神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變;采用試劑盒法檢測SOD，GSH-PX，NOS的活性和MDA，NO含量。
　　結(jié)果:
　　1、大黃酚脂質(zhì)體減輕神經(jīng)功能損傷正常對照組和假手術(shù)組，未見明顯神經(jīng)功能損害。腦缺血再灌注組神經(jīng)功能評分顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）;以24 h神經(jīng)功能評分最高。結(jié)果表明，腦缺血再灌注后可損傷小鼠神經(jīng)功能。與腦缺血再灌注2

13、4 h組比，大黃酚脂質(zhì)體(10.0，5.0，0.5mg·kg-1)組神經(jīng)功能缺陷評分均顯著降低(P＜0.05～P＜0.01)，以大黃酚脂質(zhì)體(10.0 mg·kg-1)組效果最為顯著。結(jié)果表明，大黃酚脂質(zhì)體減輕神經(jīng)功能損傷。
　　2、大黃酚脂質(zhì)體改善神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)正常對照組和假手術(shù)組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，可見豐富的細(xì)胞器。腦缺血再灌注3h可見神經(jīng)元染色質(zhì)密度增高，核膜皺縮、邊集,線粒體輕微腫脹，可見空泡。腦缺血再灌注6h神經(jīng)元染色質(zhì)密度

14、增高，核膜嚴(yán)重皺縮、邊集，線粒體部分溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分溶解，細(xì)胞器數(shù)目減少，細(xì)胞質(zhì)高度水腫，可見空泡。腦缺血再灌注12h可見核固縮，細(xì)胞核水腫，染色質(zhì)邊集，胞漿內(nèi)有大量的空泡形成，有線粒體完全溶解;腦缺血再灌注24 h可見細(xì)胞器明顯減少，線粒體結(jié)構(gòu)空泡狀，外膜隱約可見，可見凋亡小體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒;腦缺血再灌注48 h神經(jīng)元核固縮，核膜內(nèi)陷，核染色質(zhì)成團(tuán)塊狀邊集于核膜下，細(xì)胞質(zhì)高度水腫，細(xì)胞器數(shù)目少，線粒體不同程度脫空，可見溶酶體。腦缺

15、血再灌注72 h組可見神經(jīng)元核固縮，核膜溶解，核染色質(zhì)成團(tuán)塊狀邊集于核膜下，線粒體不同程度斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，細(xì)胞器少。結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷小鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。大黃酚脂質(zhì)體(10.0，5.0 mg·kg-1)組神經(jīng)元染色體比較均勻，核膜清楚，線粒體數(shù)目有所減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度腫脹，核糖體數(shù)目有一定的減少;大黃酚脂質(zhì)體(0.5 mg·kg-1)組對神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)也有改善作用。結(jié)果表明，大黃酚脂質(zhì)體改善神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。
　

16、　3、大黃酚脂質(zhì)體改善病理組織學(xué)損害正常對照組和假手術(shù)組未見明顯病理損害改變。腦缺血再灌注組3h腦缺血半球組織細(xì)胞輕度水腫，大小不等的空泡在細(xì)胞間隙出現(xiàn)，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞固縮，無明顯細(xì)胞壞死;腦缺血再灌注6h-12 h之間時，胞質(zhì)明顯水腫等上述癥狀逐漸加重;腦缺血再灌注24 h-48 h時神經(jīng)元核固縮、濃染，染色質(zhì)濃縮集聚于核周圍，呈凋亡前或凋亡改變，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)明顯破裂;腦缺血再灌注72 h時神經(jīng)元水腫逐漸減輕，部分神經(jīng)元周圍出現(xiàn)水腫。

17、結(jié)果表明，腦缺血再灌注可致小鼠腦病理組織學(xué)改變。大黃酚脂質(zhì)體治療組明顯改善腦缺血再灌注損傷后的病理組織學(xué)損傷。
　　4、大黃酚脂質(zhì)體可增強(qiáng)抗氧化能力腦缺血再灌注3 hMDA含量升高，12h后MDA含量達(dá)到最大，并持續(xù)到24 h，48 h-72 h后有所下降，與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注各時間點(diǎn)MDA含量增加有顯著性差異（P＜0.01）。腦缺血再灌注3 h SOD活性明顯降低，并與12h后SOD活性達(dá)到最低，24 h-72 h后有所增

18、加，與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注各時間點(diǎn)SOD活性降低有顯著性差異（P＜0.01）。腦缺血再灌注3 h GSH-PX活性明顯降低，并與24 h后GSH-PX活性達(dá)到最低，48 h-72 h后有所增加;與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注各時間點(diǎn)GSH-PX活性降低有顯著性差異（P＜0.01）。腦缺血再灌注3 hNO含量升高，并與6h后NO含量達(dá)到最大，并持續(xù)到24h，48 h-72 h后有所下降;與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注各時間點(diǎn)NO含量增加有顯著

19、性差異（P＜0.01）。腦缺血再灌注3 h NOS活性明顯增加，并與12h后NOS活性達(dá)到最高，并持續(xù)到24 h，48 h-72 h后有所減少;與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注組NOS活性增加有顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)果表明，腦缺血再灌注后，小鼠體內(nèi)抗氧化能力減弱。與腦缺血再灌注24 h組比，大黃酚脂質(zhì)體(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)組顯著降低MDA含量(P＜0.05～P＜0.01)，NO含量(P＜0.05～P＜0.01)

20、，NOS活性(P＜0.01，P＜0.05，P＞0.05)，顯著增強(qiáng)SOD活性（P＜0.01），GSH-PX活性(P＜0.05～P＜0.01)。以大黃酚脂質(zhì)體(10.0 mg·kg-1)組效果最為顯著。結(jié)果顯示，大黃酚脂質(zhì)體可增強(qiáng)抗氧化能力。
　　小結(jié):
　　腦缺血再灌注后，神經(jīng)功能評分，病理組織學(xué)損傷，神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷，GSH-PX，SOD，NOS的活性，MDA，NO含量呈動態(tài)改變，并且腦缺血再灌注12 h～24 h是腦缺

21、血再灌注損傷過程的重要時間轉(zhuǎn)折點(diǎn)。大黃酚脂質(zhì)體能改善小鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能評分，病理組織學(xué)損傷，神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷，提高腦組織中SOD，GSH-PX活性，抑制NOS的活性，降低腦組織中MDA，NO的含量。因此，我們推測大黃酚脂質(zhì)體可能通過抗氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)其對小鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第三部分大黃酚脂質(zhì)體對小鼠腦缺血再灌注損傷所致細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:動態(tài)觀察小鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡及Bax，Bc

22、l-2，Cytc，caspase3等動態(tài)表達(dá)變化。研究大黃酚脂質(zhì)體對腦缺血再灌注損傷小鼠的抗凋亡作用，探討大黃酚脂質(zhì)體抗凋亡作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:應(yīng)用線栓法建立小鼠腦缺血再灌注模型，采用健康雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量24～26 g。實(shí)驗(yàn)1:小鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、腦缺血再灌注組（腦缺血1h后再灌注，按再灌注不同時間點(diǎn)分為3h、6h、12h、24 h、48 h、72h6個亞組。實(shí)驗(yàn)2:小鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、腦

23、缺血再灌注24 h組、大黃酚脂質(zhì)體(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)三個劑量組。大黃酚脂質(zhì)體組于腦缺血再灌注前3天連續(xù)腹腔給予大黃酚脂質(zhì)體，每天一次。于規(guī)定時間采用Hoechst33258染色檢測神經(jīng)元凋亡;免疫組織化學(xué)法、western blot法、實(shí)時熒光定量PCR法分別檢測Bax，Bcl-2，Cytc，caspase3陽性細(xì)胞數(shù)、蛋白、mRNA水平表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、大黃酚脂質(zhì)體減少神經(jīng)元凋亡數(shù)目結(jié)果

24、顯示，正常對照組和假手術(shù)組小鼠腦組織偶見神經(jīng)元凋亡，腦缺血再灌注3h可有少量的染色體深染、核濃縮的凋亡細(xì)胞;隨著再灌注時間的延長，神經(jīng)元細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)斷裂凝集顯著增多，熒光強(qiáng)度逐漸增加。而在48 h后核深染、核濃縮，凋亡神經(jīng)元數(shù)目有所減少。與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注各組神經(jīng)元凋亡數(shù)目有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明，腦缺血再灌注可致小鼠腦神經(jīng)元凋亡。大黃酚脂質(zhì)體(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)組小鼠腦組織部分神經(jīng)元

25、染色體深染、核濃縮，神經(jīng)元凋亡數(shù)目較腦缺血再灌注24 h組均顯著減少(P＜0.05～P＜0.01)，以大黃酚脂質(zhì)體(10.0 mg·kg-1)組效果最為顯著。結(jié)果顯示，大黃酚脂質(zhì)體可顯著減少神經(jīng)元凋亡數(shù)目。
　　2、大黃酚脂質(zhì)體對細(xì)胞凋亡相關(guān)陽性細(xì)胞數(shù)變化的影響腦缺血再灌注組時Bax，Cytc，caspase3陽性細(xì)胞呈逐漸增多的趨勢，于24 h時達(dá)最高峰，再灌注48 h、72 h時有所下降。與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注組Bax，C

26、ytc，caspase3陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，具有顯著性差異（P＜0.01）。腦缺血再灌注組Bcl-2陽性細(xì)胞呈逐漸減少的趨勢，24 h時達(dá)低谷，再灌注48 h-72h時有所上升。與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注各組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)目減少具有顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)果表明，腦缺血再灌注后Bax，Cytc，caspase3陽性細(xì)胞數(shù)增加，Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)降低。與腦缺血再灌注24 h組比，大黃酚脂質(zhì)體(10.0，5.0，0.5 mg

27、·kg-1)組中Bax、Cytc、caspase3陽性細(xì)胞數(shù)均減少(P＜0.05～P＜0.01)，Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)提高(P＜0.05～P＜0.01);以大黃酚脂質(zhì)體(10.0 mg·kg-1)組效果最為顯著。
　　3、大黃酚脂質(zhì)體細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化的影響腦缺血再灌注組時Bax，Cytc，caspase3蛋白表達(dá)呈逐漸增多的趨勢，于24 h時達(dá)最高峰，再灌注48 h、72 h時有所下降。與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注組Bax，

28、Cytc，caspase3蛋白明顯上調(diào)(P＜0.01);腦缺血再灌注組Bcl-2蛋白表達(dá)呈逐漸減少的趨勢，24 h時達(dá)低谷，再灌注48 h-72 h時有所上升，與假手術(shù)組比，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05～P＜0.01)。結(jié)果表明，腦缺血再灌注增加Bax，Cytc，caspase3蛋白表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)。與腦缺血再灌注24 h組比，大黃酚脂質(zhì)體(10.0，5.0 mg·kg-1)組Bax，Cytc，caspase3蛋白表

29、達(dá)均減少(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)均提高（P＜0.01）;大黃酚脂質(zhì)體(0.5 mg·kg-1)組Bax，Bcl-2，Cytc，caspase3蛋白表達(dá)水平也有顯著性差異(P＜0.05～P＜0.01)
　　4、大黃酚脂質(zhì)體對細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA表達(dá)變化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，腦缺血再灌注各組Bax，Cytc，caspase3 mRNA水平明顯上調(diào)(P＜0.05～P＜0.01)，于腦缺血再灌注24 h時達(dá)到高峰;Bcl-2

30、 mRNA水平明顯下調(diào)（P＜0.01），于腦缺血再灌注24 h時達(dá)到低谷。結(jié)果表明，腦缺血再灌注后可上調(diào)Bax，Cytc，caspase3mRNA表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)。與腦缺血再灌注24 h組比，大黃酚脂質(zhì)體(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)組下調(diào)Bax，Cytc，caspase3 mRNA水平(P＜0.05～P＜0.01)，上調(diào)Bcl-2 mRNA水平(P＜0.01)。
　　小結(jié):
　　腦缺血再灌注