辣椒應(yīng)答UV-B的轉(zhuǎn)錄組差異分析及相關(guān)功能基因的分離.pdf

1、辣椒是我國重要的蔬菜以及工業(yè)加工原料作物，近年來發(fā)展辣椒生產(chǎn)已經(jīng)成為我國各地農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)民增收的一條有效的途徑，但在栽培過程中，各種生物與非生物產(chǎn)生的逆境脅迫，對辣椒的產(chǎn)量與品質(zhì)造成嚴(yán)重的影響，研究表明，UV-B(Ultraviolet-B)一方面可導(dǎo)致植物傷害，另一方面也可像蟲害、病害等一樣誘導(dǎo)植物產(chǎn)生各類防御反應(yīng)。雖然UV-B對植物的傷害機制已有不少的研究報道，但人們對UV-B誘導(dǎo)產(chǎn)生植物防御反應(yīng)分子機制的了解還相當(dāng)有限。本研究使用

2、cDNA-AFLP(cDNA-Amplified Fragment lengh polymorphism)技術(shù)獲得辣椒在UV-B脅迫下的表達(dá)譜，從中分析、尋找與植物防御反應(yīng)密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，并通過實時熒光定量PCR對表達(dá)發(fā)生改變的TDFs(Transcript-Derived Fragments)相應(yīng)基因的cDNA進行分離、測序驗證，主要結(jié)果如下： 1、采用cDNA-AFLP技術(shù)，得到辣椒響應(yīng)UV-B脅迫早期差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄

3、圖譜，從中發(fā)現(xiàn)了208條有差異表達(dá)TDFs，統(tǒng)計結(jié)果并將這些TDFs的功能進行分類發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)TDFs有138條，下調(diào)表達(dá)TDFs有70條；信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白為10％，防御反應(yīng)相關(guān)蛋白為22％，光合作用相關(guān)蛋白為20％，蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白為5％，碳水化合物代謝相關(guān)蛋白為2％，活性氧相關(guān)蛋白為1％，其他及未知功能蛋白分別為11％和29％。 2、采用SMARTTM cDNA文庫構(gòu)建試劑盒，構(gòu)建了辣椒響應(yīng)UV-B脅迫cDNA文庫，其滴

4、度達(dá)到了1×106 pfu/mL，重組率達(dá)到99％以上。 3、采用基于PCR技術(shù)的96孔板cDNA文庫篩選法，利用測序得來的基因片段設(shè)計引物，篩選cDNA文庫獲得了兩個應(yīng)答UV-B的親環(huán)蛋白(EU401723)和葉綠素a/b結(jié)合蛋白(EU401724)的全長cDNA。 4、應(yīng)用熒光定量PCR對親環(huán)蛋白(EU401723)和葉綠素a/b結(jié)合蛋白(EU401724)基因的cDNA-AFLP結(jié)果進行了驗證，并研究了它們在UV-

5、B、辣椒疫霉、JA(jasmonate acid)、SA(salicylie acid)、JA+SA、NaCl、4℃低溫和機械損傷等逆境或外源激素作用下的表達(dá)，定量的結(jié)果表明：A.UV-B處理下，兩個基因的表達(dá)強弱及變化趨勢基本上與cDNA-AFLP結(jié)果相一致，從而也驗證了cDNA-AFLP結(jié)果的可靠性。B.UV-B處理下的辣椒親環(huán)蛋白基因表達(dá)量較對照基因相比呈總體下降的趨勢；在Nacl和機械損傷的誘導(dǎo)下，該基因的表達(dá)量明顯上升，表明該

6、基因在應(yīng)答鹽脅迫和疫霉脅迫中，很可能參與了相關(guān)的防御反應(yīng)。C.葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因在UV-B處理的熒光定量PCR分析中顯示，在UV-B處理的10min內(nèi)其表達(dá)量有所上升，隨著處理時間的延長，該基因的表達(dá)量較對照基因相比有所下降；停掉UV-B處理后的2h內(nèi)，該基因的表達(dá)量明顯上升，且隨著處理時間的延長其表達(dá)量又與對照基因的表達(dá)量持平。說明該基因很可能參與了應(yīng)答UV-B脅迫的防御反應(yīng)與修復(fù)的分子機制中。在疫霉，JA，JA+SA處理的12