葉酸受體α在高同型半胱氨酸損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通路中的調(diào)控角色及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　探討高同型半胱氨酸對(duì)葉酸受體基因表達(dá)的影響。觀察沉默葉酸受體α對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡的影響，探討這一過(guò)程與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中較關(guān)鍵的靶蛋白PERK激活的關(guān)系。
　　方法：
　　1、用0μM/L、50μM/L、100μM/L、200μM/L、500μM/L幾種不同濃度的同型半胱氨酸干預(yù)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：24小時(shí)后倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生的變化；CCK-8法檢測(cè)各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的存活率；R

2、eal-timeqPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞5種葉酸受體基因FOLR1、FOLR2、FOLR3、SLC46A1、SLC19A1的mRNA表達(dá)水平；Westernblot法檢測(cè)FRα的蛋白表達(dá)水平。
　　2、脂質(zhì)體法將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HUVECs后，用熒光顯微鏡觀察HUVECs內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，并用Westernblot法檢測(cè)FRα蛋白的表達(dá)，篩選出轉(zhuǎn)染效果最佳的FRα-siRNA片段。
　　3、將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)

3、照siRNA組、FRα-siRNA組。AnnexinV+PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVECs的細(xì)胞凋亡率，westernblot檢測(cè)PERK及p-PERK蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、隨著Hcy濃度的升高，HUVECs在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)損傷變化，細(xì)胞生存率逐漸降低。當(dāng)Hcy＞50μM/L時(shí)，作用24小時(shí)后，HUVECs的生存率較空白對(duì)照組逐漸下降（P＜0.05），濃度越高，細(xì)胞生存率越低，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

4、。
　　2、在HUVECs中，F(xiàn)OLR2、FOLR3特別是FOLR2的mRNA表達(dá)量非常低。隨著Hcy濃度的升高，F(xiàn)OLR1mRNA表達(dá)量分別先升高后降低，SLC46A1的mRNA表達(dá)量先升高后趨于不變。FOLR1、SLC46A1、SLC19A1mRNA相對(duì)表達(dá)量均在50μM/LHcy干預(yù)組達(dá)到各組的峰值，與各組的空白對(duì)照組的相比升高（P＜0.05）。200μM/LHcy干預(yù)組的FOLR1mRNA相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組相比下降（P

5、＜0.05）。
　　3、隨著Hcy濃度的升高，F(xiàn)Rα蛋白呈現(xiàn)先升高后降低的變化，50μM/LHcy干預(yù)時(shí)達(dá)到峰值。與空白對(duì)照組相比，50μM/LHcy干預(yù)組FRα蛋白表達(dá)量增加（P＜0.01），200μM/LHcy干預(yù)組FRα蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。100μM/LHcy干預(yù)組與空白對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。100μM/LHcy干預(yù)組、200μM/LHcy干預(yù)組的FRα蛋白表達(dá)量低于50μM/LHcy干預(yù)組(

6、P＜0.01)。200μM/LHcy干預(yù)組的FRα蛋白表達(dá)量低于100μM/LHcy干預(yù)組(P＜0.01)。
　　4、倒置熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照片段、3種FR-siRNA干擾片段FOLR1-homo-132、FOLR1-homo-272、FOLR1-homo-597的HUVECs均可觀察到綠色熒光，平均轉(zhuǎn)染效率75％。Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后FRα蛋白的表達(dá)抑制情況，3種FRα干擾片段均能有效抑制FRα在人臍靜脈內(nèi)皮

7、細(xì)胞中的表達(dá)，其中FOLR1-homo-132干擾片段抑制效率最高，計(jì)算蛋白抑制率為87.19%。
　　5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs12h后，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、FRα干擾組細(xì)胞的凋亡率(%)分別為：3.56±1.2、5.12±2.1、20.6±3.0。FRα干擾組與陰性片段轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組相比，凋亡率增加（P＜0.01）。
　　6、Westernblot測(cè)得空白對(duì)照組p-PERK的蛋白表達(dá)量低；FRα

8、干組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，p-PERK的蛋白表達(dá)量增加，p-PERK/PERK比值升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、同型半胱氨酸可以使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生損傷性變化，降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞生存率，這種作用具有劑量依賴性。
　　2、FOLR2、FOLR3特別是FOLR2的mRNA表達(dá)量在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中非常低。同型半胱氨酸可以對(duì)FOLR1、SLC46A1、SLC19A1的

9、mRNA在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)有先促進(jìn)再抑制的作用。
　　3、濃度不斷升高的同型半胱氨酸可以影響以FRα為代表的葉酸受體的表達(dá)，對(duì)FRα的mRNA及蛋白表達(dá)呈先促進(jìn)再抑制的作用，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。
　　4、沉默F(xiàn)Rα能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　5、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的標(biāo)志分子PERK可能參與了沉默F(xiàn)Rα的表達(dá)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡的過(guò)程。
　　6、FRα可能是高同型半胱氨酸損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)