同型半胱氨酸致血管內(nèi)皮細胞損傷機制的研究.pdf

1、研究背景與目的：同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是一種含硫氨基酸，體內(nèi)不能合成，只能來源于蛋氨酸的分解代謝，在體內(nèi)主要以蛋白結(jié)合形式存在。其生理作用主要是參與體內(nèi)一碳單位的代謝。目前公認，體內(nèi)Hcy濃度升高是導(dǎo)致心血管疾病的獨立危險因素之一。因此，對同型半胱氨酸在各種心腦血管疾病發(fā)病機制中所發(fā)揮作用的深入研究具有重要的理論和應(yīng)用價值。研究表明，Hcy對血管內(nèi)皮細胞的損傷作用是其致病機制的始動因素。但Hcy內(nèi)皮損傷機制的研

2、究沒有得出一個系統(tǒng)的有說服力的結(jié)論。本次研究的主要目的是利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究的理論和技術(shù)，對Hcy作用后的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的蛋白質(zhì)表達譜進行觀察和分析，尋找與Hcy作用相關(guān)的蛋白質(zhì)改變，更全面的了解Hcy所引起的細胞內(nèi)功能蛋白的變化，為Hcy致血管內(nèi)皮損傷機制的研究提供新的數(shù)據(jù)。 材料與方法：運用流式細胞技術(shù)對Hcy作用后的HUVEC進行細胞凋亡檢測；用凋亡相關(guān)基因芯片技術(shù)獲得Hcy作用后的HUVEC凋亡相關(guān)基因表達

3、譜，利用RT-PCR、WesternBlot對其結(jié)果進行驗證，全面分析Hcy誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡的信號通路；采用2DE-MS技術(shù)路線對Hcy作用下的HUVEC蛋白質(zhì)表達譜進行研究，并運用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對Hcy作用后發(fā)生改變的蛋白質(zhì)進行功能分析和相互作用分析。 第1頁共148頁結(jié)果：Hcy作用后可檢測到凋亡細胞的存在，并且凋亡細胞數(shù)與Hcy濃度呈正相關(guān)；凋亡相關(guān)基因芯片檢測結(jié)果以及RT-PCR、Western-blot檢測結(jié)果表

4、明，Hcy可以誘導(dǎo)12種凋亡相關(guān)基因表達下調(diào)，分別是：ASC、Bcl-2、BFL1、Blk、caspase-9、FLIP、DAPK2、DFF40、HRK、LTA、LTB、RPA3，16種基因表達下調(diào)，分別是Apaf-1、Bak、caspase-6、caspase-7、caspase-8、DcR1、TNFR1、Fas/CD95、CD27、TRAIL、TNFSF12、TNFSF14、TNFSF9、P53、TRAF2、TRAF3。經(jīng)2DE-M

5、S蛋白質(zhì)表達譜分析，共鑒定出27種蛋白質(zhì)表達水平在Hcy作用后發(fā)生改變，表達下降的有：calreticulinprecursor、tubulin、HnRNPK、ATPsynthasealphachain(mitochondrialprecursor)、Fascin、Keratin、Reticulocalbin1precursor、poly(rC)-bindingprotein2isoformα、calponin,acidicisofor

6、m、hnRNPA/B、spliceisoform2ofp07226tropomyosinbeta4chain、putativeRNA-bindingprotein3、inorganicpyrophosphatase、proteasomesubunitbetatype7precursor、phosphoglyceratemutase1、superoxidedismutase[Mn]、stathmin、prefoldinsubunit5、e

7、IF-5A和一個Unknown(proteinforMGC：5321)，表達升高的有：β-Actin、alphaenolase、Myo5C、peroxiredoxin 4、peroxiredoxin1、hypotheticalprotein，以及annexinⅪ。其中，AnnexinⅪ，UBA/UBX33.3，Unknown(proteinforMGC：5321)和一個hypotheticalprotein尚無相關(guān)功能研究報道。

8、經(jīng)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索和相互作用分析發(fā)現(xiàn)，c-myc、ATP5A1、FSCN1、hnRNPK四個分子似乎是本次實驗所獲得的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的結(jié)點。 結(jié)論：綜合凋亡相關(guān)基因表達譜和蛋白質(zhì)表達譜的研究結(jié)果進行分析，我們認為，在Hcy的血管內(nèi)皮損傷機制中，以Hcy的誘導(dǎo)細胞凋亡作用為主要作用方式，并且主要是通過死亡受體通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡。但由于目前2DE-MS技術(shù)路線本身的缺陷，主要是對微量蛋白檢出能力較低，影響了對Hcy作用