內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子對不同心臟手術(shù)心肌保護(hù)作用的對比研究.pdf

1、目的:在心臟外科的研究中，心肌保護(hù)一直是研究的熱點(diǎn)，心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是在術(shù)中導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的最主要因素，也是主要的研究方向。MIRI是一個(gè)多因素的病理生理過程，目前已知的通路主要有鈣離子超載、線粒體途徑、微血管創(chuàng)傷、炎癥反應(yīng)以及脂類物質(zhì)超氧化等機(jī)制，在此研究之上，近年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)可以影響細(xì)胞凋亡及組織的炎癥反應(yīng)并且在MIRI中發(fā)揮重要作用。在ERS中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)以保護(hù)由ERS所引起

2、的細(xì)胞損傷，恢復(fù)細(xì)胞功能。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)可以促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白折疊、恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，起到保護(hù)細(xì)胞的作用，同時(shí)也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的信號，與介導(dǎo)凋亡途徑的跨膜蛋白結(jié)合，使其處于失活狀態(tài)。Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞漿面，該物質(zhì)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的一種特異性介質(zhì)，僅僅存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中，并介通過激活Caspase-3介導(dǎo)凋亡。核因子-kB(NF-kB)是一個(gè)多向性核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在多種急性應(yīng)激反應(yīng)中表達(dá)，目前被認(rèn)為是內(nèi)

3、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，關(guān)于其的損傷心肌作用和心肌保護(hù)作用均有報(bào)道，上述三種蛋白及調(diào)控因子具體作用機(jī)制復(fù)雜且先前的研究多在細(xì)胞層面進(jìn)行，關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦或人體中的實(shí)驗(yàn)?zāi)壳吧写M(jìn)一步研究。對于減少術(shù)中心肌損傷，體外循環(huán)下心臟不停跳手術(shù)有獨(dú)到的優(yōu)勢，其術(shù)式在90年代末開始開展應(yīng)用，并逐漸發(fā)展，已有了長足的進(jìn)步，關(guān)于該術(shù)式的研究也充分證明了其有良好的預(yù)防MIRI作用，可以有效的進(jìn)行腦、肺、腎臟等多臟器的保護(hù)。但關(guān)于其分子層面的研究目前

4、尚少。本實(shí)驗(yàn)建立體外循環(huán)的模型，探索心臟停跳及不停跳手術(shù)的情況下，ERS的反應(yīng)強(qiáng)度及細(xì)胞凋亡程度，探索ERS以及其中的三種調(diào)節(jié)因子在不同手術(shù)方式下的表達(dá)情況，并對比手術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　方法:動(dòng)物由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，為成年新西蘭大白兔共36只，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為停跳組(體外循環(huán)心臟停跳組，n=12)，不停跳組(體外循環(huán)心臟不停跳組，n=12)以及對照組（假手術(shù)組）。建立兔體外循環(huán)模型。假手術(shù)組僅作開關(guān)胸手術(shù)，不做其他處理

5、。不停跳組體外通過頸總動(dòng)脈作為動(dòng)脈灌注，頸總靜脈作為靜脈引流，進(jìn)而建立循環(huán)，維持體外循環(huán)約120min，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不進(jìn)行停跳液的灌注、不阻斷升主動(dòng)脈及上下腔靜脈、冠狀動(dòng)脈維持血流灌注。停跳組建立體外循環(huán)后，并行循環(huán)約15min，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物溫度降低至28℃～30℃時(shí)將主動(dòng)脈阻斷，并從主動(dòng)脈根部灌注St.ThomasⅡ停搏液（15ml/kg，約4℃），總共灌注3次St.ThomasⅡ停搏液（后兩次分別于30min和60min分別進(jìn)行，灌

6、注量為第一次的一半）。灌注完畢后緩慢復(fù)溫，于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于34℃時(shí)基本恢復(fù)全流量，最后使心臟復(fù)跳并行體外循環(huán)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命體征平穩(wěn)后停止體外循環(huán)操作。實(shí)驗(yàn)成功的標(biāo)志為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在停止體外循環(huán)1個(gè)小時(shí)后仍存活，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行心肌標(biāo)本的采集。根據(jù)免疫組化試劑盒的步驟分別對三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌進(jìn)行GRP78、Caspase-12以及NF-kB的表達(dá)檢測，并對三組動(dòng)物的心肌行TUNEL法檢測凋亡率。
　　結(jié)果:(1)GRP78的表達(dá)量:停跳組

7、(72.24％±7.89％)，不停跳組(16.53％±2.59％)，假手術(shù)組(1.68％±1.19％)，組間差別有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　(2)NF-kB的表達(dá)量:停跳組(73.70％±6.70％)，不停跳組(13.81％±1.79％)，假手術(shù)組(2.42％±1.42％)，組間差別有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)
　　(3)Caspase-12的表達(dá)量:停跳組(73.74％±7.15％)，不停跳組(14.49％

8、±2.29％)，假手術(shù)組(2.46％±1.56％)，組間差別有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)
　　(4)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI):心臟停跳組凋亡率為(10.11±0.53)，心臟不停跳組(4.27±0.61)，對照組為(1.33±0.35)(P＜0.01)。組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)
　　(5)相關(guān)性分析:心臟停跳組以及心臟不停跳組心肌細(xì)胞凋亡率與該組caspase-12表達(dá)量相關(guān)系數(shù)分別為為0.961(P＜0.0

9、1)以及0.912(P＜0.01)，呈明顯的正相關(guān);與該組GRP78表達(dá)量相關(guān)系數(shù)分別為0.827(P＜0.01)以及0.831(P＜0.01)，呈正相關(guān)，與該組NF-kB表達(dá)量相關(guān)系數(shù)分別為0.317(P＞0.05)以及0.281(P＞0.05)，無明顯相關(guān)性;
　　結(jié)論:(1)GRP78在心臟停跳及不停跳組中都明顯升高，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了體外循環(huán)中細(xì)胞的損傷。
　　(2)Caspase-12在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中明顯升高說明了