內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白MANF在脾臟中的表達.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是真核細胞的一種保護性應(yīng)激反應(yīng),通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)通路來減少細胞內(nèi)蛋白的異常聚集,從而起到細胞保護作用。ER應(yīng)激與很多因素所致疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明,ER應(yīng)激及其UPR通路可能參與機體的炎癥免疫反應(yīng)。脾臟是機體細胞免疫和體液免疫中心,參與先天免疫和獲得性免疫。脾

2、臟能夠清除循環(huán)中的衰老紅細胞,并能有效去除血源性細菌和細胞殘片;加之它的T、B淋巴細胞的高度有序分布,使得脾臟成為抗菌最重要的器官。MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)基因是從30000個基因中篩選出的對ER應(yīng)激最敏感的基因,它是一種分泌性蛋白,ER應(yīng)激能誘導其表達上調(diào)。故推測,MANF可能選擇性表達于脾細胞中,在脾臟的發(fā)育和漿細胞分化中發(fā)揮重要的作

3、用。
　　目的:
　　本研究的目的是觀察大鼠出生后不同發(fā)育階段脾臟的結(jié)構(gòu)變化、漿細胞的發(fā)育與分化以及MANF蛋白在脾細胞中選擇性的表達情況,為研究MANF的生物學活性與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　選取不同發(fā)育時期鼠的脾臟,并制備組織標本。分別采用HE染色、免疫組織化學及免疫熒光技術(shù),觀察大鼠不同時期脾臟的結(jié)構(gòu)及CD138(漿細胞)、CD68(巨噬細胞)陽性細胞的發(fā)育特點以及出生后不同時期MANF

4、在脾臟中的表達情況;使用T、B淋巴細胞的表面標記物CD3及CD20,觀察MANF在成年鼠及外傷切除的人脾臟中各類淋巴細胞中差異性的表達特點。用弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,FCA)制備大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)模型,觀察MANF在炎性大鼠脾臟中的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠出生后不同時期脾臟的發(fā)育
　　1.1脾臟結(jié)構(gòu)的發(fā)育
　　大鼠

5、在出生后1~4 wk,脾臟的白髓和紅髓發(fā)育不成熟,沒有完整的白髓結(jié)構(gòu)和血管結(jié)構(gòu),而出現(xiàn)大量的細胞團;6 wk時白髓有雛形,脾臟的白髓和紅髓中出現(xiàn)血管樣結(jié)構(gòu);8 wk時白髓具有典型的結(jié)構(gòu)特征,如中央動脈周圍有大量的T細胞形成的PALS及B細胞組成的濾泡。
　　1.2CD68陽性細胞的發(fā)育
　　大鼠出生后1 wk,脾臟組織中即有大量的、散在分布的、呈分枝狀的CD68陽性的細胞;而在出生6 wk后,巨噬細胞呈圓形或阿米巴狀,細胞內(nèi)

6、CD68的表達量在12-22 wk時明顯增加。
　　1.3CD138陽性細胞的發(fā)育
　　大鼠在出生后1~4 wk,脾臟組織中無CD138陽性的漿細胞;6 wk后,脾臟的白髓和紅髓中少量的CD138陽性細胞;8 wk時白髓中有大量的CD138陽性細胞,此時CD138的表達量達到峰值,而后隨著月齡的增加CD138的表達有緩慢下降趨勢。
　　1.4MANF的表達
　　大鼠在出生后1~4wk,MANF在脾臟中廣泛表達,尤

7、其是在成團細胞的中MANF也有表達;6~12wk后,MANF在散在的細胞中表達,且定位于胞漿。這些MANF陽性細胞多數(shù)分布在邊緣區(qū)和紅髓中;少數(shù)分布在動脈周圍淋巴鞘中。而22wk后,MANF則彌散分布于胞漿中。
　　免疫熒光雙標發(fā)現(xiàn),1-3 wk時MANF不在CD68陽性細胞中表達。在出生后4 wk時在少量的CD68細胞中有MANF表達,此后表達MANF的CD68細胞逐漸增多。由于CD138陽性細胞在出生后6 wk時才出現(xiàn),此時部

8、分CD138陽性細胞中有MANF表達;8 wk后CD138陽性細胞與MANF共染細胞開始逐步增加,至10 wk達到峰值,而后隨著年齡的增加MANF+CD138+數(shù)量有緩慢下降。
　　2.MANF在成熟脾臟中的選擇性表達
　　在成熟大鼠和人的脾臟中,MANF陽性細胞主要出現(xiàn)在紅髓和邊緣區(qū),不存在于白髓中,且MANF的表達主要定位于胞漿中,而不是細胞核中。MANF陽性細胞的分布與CD138和CD68陽性細胞的分布一致,該結(jié)果提示

9、MANF在成熟脾細胞中可能在漿細胞和巨噬細胞中表達。為了證實該結(jié)果,我們進一步進行免疫熒光雙標。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MANF不在CD20陽性的淋巴細胞中表達,只有極少數(shù)的CD3陽性細胞中有MANF的表達,而MANF主要在CD68和CD138陽性細胞中表達。該結(jié)果提示MANF的表達可能與ER應(yīng)激有關(guān)。
　　3.UPR通路蛋白在MANF陽性細胞中的表達
　　在成年人的脾細胞中,大多數(shù)表達BIP、CHOP、ATF6和 XBP1的細胞中有MA

10、NF表達,而僅有少數(shù)BIP、CHOP、ATF6或XBP1陽性細胞不表達MANF;在CD68陽性的細胞中有BIP和CHOP表達,但無XBP1的表達;在CD138陽性細胞中有BIP和XBP1的表達,而無CHOP的表達。上述結(jié)果提示,CD138陽性的漿細胞中存在ER應(yīng)激,MANF的表達可能與ER應(yīng)激有關(guān)。
　　4.MANF在AA大鼠脾臟中表達
　　在AA大鼠,免疫系統(tǒng)被激活,脾臟中的淋巴細胞相應(yīng)也被激活。研究發(fā)現(xiàn),在AA大鼠的脾臟

11、中,MANF的表達量明顯增多,并集中在脾臟邊緣區(qū),提示炎癥也誘導MANF在脾細胞中的表達。
　　結(jié)論：(1)脾臟中漿細胞的分化滯后于巨噬細胞,出生早期機體主要以非特異性免疫為主。(2)MANF在脾細胞中選擇性表達,其主要在漿細胞和巨噬細胞中表達,這可能與這些細胞的分化和功能有關(guān)。(3)漿細胞和巨噬細胞中均存在ER應(yīng)激,而漿細胞中UPR通路被激活,MANF的表達與ER應(yīng)激有關(guān);(4)免疫性關(guān)節(jié)炎癥大鼠脾臟中MANF表達上調(diào),提示炎癥