鮑氏層孔菌菌絲體多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性的研究.pdf

1、鮑氏層孔菌(Phellinus baumii Pilát)為擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的珍稀藥用真菌。其子實(shí)體俗稱桑黃,為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材。近年來(lái)的研究表明,其子實(shí)體提取物具有抗腫瘤、免疫刺激、抗突變、降血糖、抗氧化和清除自由基等活性。到目前為止,人們對(duì)鮑氏層孔菌的研究大多數(shù)集中在子實(shí)體的粗多糖的研究,而對(duì)液體培養(yǎng)的鮑氏層孔菌菌絲體多糖(P

2、BMP)的分離純化、理化性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行深入研究的報(bào)道甚少。
　　 傳統(tǒng)上,鮑氏層孔菌的活性成分多糖通常從子實(shí)體中提?。坏捎邗U氏層孔菌野生資源(子實(shí)體)的日益匱乏,加之人工栽培周期長(zhǎng)、難度較大,這已限制了對(duì)該菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。而液體深層發(fā)酵具有周期短、菌絲體多糖產(chǎn)量高、條件控制容易、污染少、便于發(fā)酵下游加工處理以及工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn),是大量獲取菌絲體多糖的理想途徑,因此,采用液體深層發(fā)酵方法是目前開(kāi)發(fā)鮑氏層孔菌活性

3、成分的一條有效途徑。為了系統(tǒng)的研究鮑氏層孔菌菌絲體多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性,本研究對(duì)鮑氏層孔菌進(jìn)行了液體深層發(fā)酵培養(yǎng),并對(duì)其菌絲體多糖進(jìn)行了提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和藥理活性進(jìn)行研究。
　　 本論文共有四個(gè)部分,分別從菌絲體的深層發(fā)酵條件優(yōu)化、多糖分離純化、理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒定、體外清除自由基、體內(nèi)對(duì)半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠氧化應(yīng)激的影響以及免疫調(diào)節(jié)和體外抑瘤活性進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下:
　　 1.液體培養(yǎng)的鮑氏層孔菌多糖發(fā)

4、酵條件的優(yōu)化運(yùn)用2(7-3)部分因子設(shè)計(jì)(FFD)篩選出影響鮑氏層孔菌菌絲體多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因素:葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及硫酸鎂；采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)中的中心組合設(shè)計(jì)(CCD)對(duì)有顯著影響菌絲體多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵因素水平進(jìn)行優(yōu)化,確定培養(yǎng)基的組成分別為(g/l):葡萄糖35.36,酵母膏2.88,蛋白胨2.73,MgSO41.47,KH2PO41,VB10.0075,草酸銨0.3.
　　 在優(yōu)化的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,運(yùn)用中心組合設(shè)計(jì)對(duì)鮑氏層孔菌

5、液體發(fā)酵的溫度和pH進(jìn)行優(yōu)化,篩選出了鮑氏層孔菌液體發(fā)酵的溫度和pH的條件為分別為28℃、6.0。在培養(yǎng)基成分、溫度和pH優(yōu)化基礎(chǔ)上,對(duì)P.baumii Pilát分批發(fā)酵過(guò)程中的相關(guān)指標(biāo)(菌絲體多糖產(chǎn)量、菌絲體生物量、殘?zhí)恰H值)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明,在發(fā)酵進(jìn)行144 h時(shí)菌球生長(zhǎng)良好,菌絲體干重、菌絲體多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值,分別為13.69 g/l、0.94 g/l。由此可見(jiàn),利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法對(duì)鮑氏層孔菌菌絲體多糖產(chǎn)量的

6、發(fā)酵條件優(yōu)化是經(jīng)濟(jì)可行,科學(xué)合理。
　　 2.鮑氏層孔菌菌絲體多糖提取、分離純化、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析液體發(fā)酵得到的菌絲體經(jīng)干燥、粉碎、水提、75％乙醇沉淀、離心,然后用無(wú)水乙醇、丙酮以及乙醚洗滌、干燥,即得到鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖。多糖的提取率為6.72％。
　　 運(yùn)用DEAE-纖維素-52陰離子交換柱層析法對(duì)鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進(jìn)行初步分離,初步得到三個(gè)純化組分F1、F2和F3；再利用葡聚糖G-100凝膠過(guò)濾柱層析法

7、對(duì)初步純化組分F1、F2和F3進(jìn)行進(jìn)一步純化,得到鮑氏層孔菌菌絲體多糖純化組分PBMP—1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3四個(gè)組分,其得率分別為32.57％、4.13％、5.08％和0.79％。
　　 采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍(lán)法和硫酸-間羥聯(lián)苯法測(cè)定了PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3四個(gè)多糖組分的總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量,其總糖含量分別為99.49％、77.02％、92.03％和71.

8、19％；蛋白質(zhì)含量分別為未檢出、4.99％、1.54％和4.45％,糖醛酸含量分別為2.01％、3.74％、4.29％和5.27％。
　　 采用高效液相凝膠滲透色譜法(HPGPC)對(duì)PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3的相對(duì)分子量進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)其純度進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。結(jié)果表明PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3四個(gè)組分都是均一的多糖組分,且其分子量分別為2.95×103 kDa、1.17

9、×103 kDa、16.29 kDa和1.54×103 kDa。
　　 通過(guò)糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法測(cè)定了4個(gè)多糖組分的單糖組成:PBMP-1由3種單糖組成,其摩爾比為:巖藻糖:葡萄糖:半乳糖=1.00:24.54:0.29:PBMP-2a由4種單糖組成,其摩爾比為:巖藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.56:0.76:3.23:1.00；PBMP-2b由4種單糖組成,其摩爾比為:巖藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.23:1.

10、29:1.00:1.01:PBMP-3由5種單糖組成,其摩爾比為:鼠李糖:巖藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.52:0.58:2.51:1.44:1.00。
　　 FTIR技術(shù)研究表明:PBMP-1、PBMP-2a和PBMP-2b三個(gè)組分的糖環(huán)形式均為吡喃糖環(huán)；PBMP-1的糖苷鍵構(gòu)型均為α型,PBMP-2a和PBMP-21b的糖苷鍵構(gòu)型既有α型又有β型。UV掃描表明:PBMP-2a和PBMP-2b中具有少量蛋白質(zhì),而PBMP-

11、1中不合蛋白質(zhì)。
　　 高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應(yīng)、GC/MS以及NMR技術(shù)研究表明:PBMP-1多糖組分的基本結(jié)構(gòu):α型糖苷鍵構(gòu)型連接,以1,4-葡萄糖殘基和1,6-半乳糖殘基構(gòu)成主鏈,同時(shí)以巖藻糖為非還原末端、含有1,3,4-葡萄糖分支和1,4,6-葡萄糖分支等高度分支的不均一多糖；PBMP-2a含有α和β型糖苷鍵,并以α型糖苷鍵為主要連接類(lèi)型,是以1,4-葡萄糖殘基和1,6-半乳糖殘基構(gòu)成主鏈,以少量的巖藻糖、

12、葡萄糖和甘露糖為非還原末端,并帶有1,6-葡萄糖分支、1,3,4-葡萄糖分支、1,4,6-葡萄糖分支、1,2-甘露糖分支、1,2,6-甘露糖分支的復(fù)合多糖；PBMP-2b含有α和β型糖苷鍵,并以α型糖苷鍵為主要連接類(lèi)型的復(fù)合多糖,是以1,2,6-甘露糖殘基和1,3,4-葡萄糖殘基構(gòu)成多分支的主鏈,并在甘露糖C6位、葡萄糖C3位上面連接巖藻糖或甘露糖或葡萄糖與1,6-半乳糖構(gòu)成的側(cè)鏈。
　　 3.鮑氏層孔菌菌絲體多糖清除自由基作用

13、及其對(duì)半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠氧化應(yīng)激影響采用化學(xué)方法分別研究了鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP-1的體外清除O2·自由基、OH·羥基自由基以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)活性。結(jié)果表明,鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP-1能夠清除超氧陰離子自由基O2·、羥基自由基OH·,并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生,而且粗多糖較純化的多糖組分具有較強(qiáng)的活性。
　　 運(yùn)用D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老動(dòng)物模型,考察了鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖

14、PBMP及其純化組分PBMP-1對(duì)半乳糖引起的小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射D-半乳糖可引起機(jī)體氧化損傷,顯著增加肝臟和血清中MDA含量,明顯降低肝臟和血清中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性以及非酶抗氧化能力TAOC水平。而應(yīng)用鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP—1處理,可減弱D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng),顯著提高肝臟和血清中SOD活性、CAT活性、GSH—Px活性以及TAOC水平,顯著降低肝臟和血清

15、中MDA含量,且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。同時(shí),不同劑量的鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP組、純化組分PBMP-1組能明顯提高衰老小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù),這可能與其提高機(jī)體抗氧化活性,減輕自由基對(duì)生物膜的損害,從而保護(hù)機(jī)體及免疫器官免受自由基攻擊有關(guān)。
　　 4.鮑氏層孔菌菌絲體多糖的免疫調(diào)節(jié)與體外抑瘤活性研究采用體外脾細(xì)胞模型研究分析了鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖及其純化組分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3的免

16、疫活性。結(jié)果顯示鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP-1、PBMP-2a和PBMP-2b對(duì)不加有絲分裂原刺激的脾細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用；同時(shí)對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖與LPS刺激的B淋巴細(xì)胞增殖均有一定協(xié)同作用,且刺激程度存在一定的差異。而純化組分PBMP-3對(duì)單獨(dú)或有有絲分裂原刺激的脾細(xì)胞增殖均沒(méi)有促進(jìn)作用,反而具有一定的免疫抑制作用。
　　 采用體外巨噬細(xì)胞模型研究分析了鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖及其純化組分

17、PBMP—1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3的免疫活性。鮑氏層孔菌菌絲體多糖具有提高腹腔巨嗜細(xì)胞酸性磷酸酶活性、增強(qiáng)腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬中性紅能力,且這種作用與多糖濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)的量效關(guān)系。
　　 采用MTT法對(duì)鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化組分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3在體外抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明,鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖PBMP及其純化

18、組分PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3作用24、48、72 h,均能不同程度的抑制BGC-823細(xì)胞的增殖,且抑制作用與多糖之間存在明顯正相關(guān)的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。在50μg/ml濃度、作用72 h時(shí),PBMP-1、PBMP-2a、PBMP-2b和PBMP-3等多糖組分對(duì)BGC-823的體外抑瘤率達(dá)到81.98％、90.68％、90.27％和90.05％,已經(jīng)接近陽(yáng)性對(duì)照(順鉑,5μg/ml)的抑制率(95.30