靶向程序性死亡因子配體1的新型免疫細胞因子的制備及抗腫瘤功能研究.pdf

1、目的:
　　靶向PD-L1的單抗具有免疫激活功能，并已顯示出對多種腫瘤的良好治療效果。其主要作用原理是通過阻止腫瘤細胞表面PD-L1分子與T細胞表面PD-1分子的結(jié)合，從而解除其對T細胞的抑制作用，增強抗腫瘤免疫效應。但由于臨床上某些腫瘤細胞表面PD-L1低表達，應用抗PD-L1單抗治療的療效較差，病情易反復。因此需要開發(fā)新型抗腫瘤免疫制劑來提高單抗療效，改善腫瘤愈后。IL-2因能激活體內(nèi)多種免疫細胞而可以用來治療腫瘤和炎癥性疾病

2、。但由于其受體廣泛表達，系統(tǒng)性應用IL-2會引起嚴重的不良反應。因此，我們采用基因工程技術，將靶向PD-L1抗體的Fc段與IL-2分子融合，構建新型重組免疫細胞因子。其目的是使之能特異性靶向腫瘤區(qū)域，避免非特異性結(jié)合導致的的血管毒性;同時阻斷PD-1/PD-L1結(jié)合，使機體的適應性免疫協(xié)同特異性免疫，激活T細胞，B細胞等多種淋巴細胞，釋放細胞因子，以期達到對抗原表達量低，單用抗體效果不明顯腫瘤的更好治療效果。
　　方法:
　

3、　首先，利用全基因合成技術將抗PD-L1單抗的IgG1亞類抗體的Fc重鏈基因通過linker與突變后的IL-2基因融合，連接至表達載體pc3.1DNA，構建重鏈質(zhì)粒。MPDL3280單抗的可變區(qū)基因連接至表達載體pcDNA3.1構建輕鏈質(zhì)粒，并與重鏈質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入CHO細胞中進行表達。經(jīng)過細胞批次培養(yǎng)，純化上清得到新型重組免疫細胞因子，簡稱BIPI。利用以下手段對其進行表征鑒定:SDS-PAGE分析其分子量;FCM測定BIPI的親和力和抗

4、原結(jié)合力;體外檢測其對小鼠T淋巴細胞系CTLL-2細胞的促增殖作用;在小鼠的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌預防性腫瘤模型中評估其抑瘤活性，并在治療過程中監(jiān)測小鼠體重，評估BIPI的安全性;利用抗體消除小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的CD8+T細胞，驗證其在抑瘤過程中的作用;最后分離各治療組小鼠脾細胞，用磁珠法從混合細胞中分離得到CD8+T細胞，測定并比較各組間CD8+T細胞數(shù)量上的差異和其IFN-γ分泌量的不同，驗證BIPI對體內(nèi)免疫系統(tǒng)的激活作用并分析免疫細胞因子的作

5、用機制。
　　結(jié)果:
　　我們獲得了新型免疫細胞因子，經(jīng)分析其純度大于99％。經(jīng)SDS-PAGE、FCM等試驗證實BIPI結(jié)構正確并且與抗原有較好的結(jié)合活性。體外實驗中，含有與IL-2同等摩爾質(zhì)量的BIPI與IL-2標準品有幾乎相同的促進CTLL-2細胞生長的效能。在弱表達PD-L1的CT26轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌小鼠模型上，與對照組相比顯著減少了肺表面腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量，證實了免疫細胞因子BIPI的抑瘤活性。在后續(xù)對其抑瘤機制研究的過

6、程中發(fā)現(xiàn)，CD8+T細胞在BIPI的抑瘤效果發(fā)揮上有重要作用;消除CD8+T細胞后，小鼠的生存期顯著縮短，并且生存狀態(tài)不佳。在治療結(jié)束后，將CD8+T細胞分離后培養(yǎng)，檢測其IFN-γ分泌量，結(jié)果顯示BIPI治療組顯著高于其他對照組，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。在體重監(jiān)測過程中各組小鼠體重均未發(fā)生異常改變，說明治療性藥物并未對小鼠產(chǎn)生明顯毒性，提示其安全性良好。
　　結(jié)論:
　　經(jīng)過實驗證實，我們所構建的新型重組免疫細胞因子BIPI具