環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株MS-UD5的選育、發(fā)酵條件優(yōu)化與酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Cyclodextrin glucanotransferase，簡(jiǎn)稱CGTase，EC2．4．1．19)屬于a-淀粉酶家族，能夠催化淀粉及相關(guān)基質(zhì)進(jìn)行分子間轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)合成環(huán)糊精(Cyclodextrin，CD)。CD是一種具有內(nèi)疏水外親水的筒形結(jié)構(gòu)，能與許多疏水客體化合物或功能基團(tuán)形成包含物，從而改變其物理或化學(xué)性質(zhì)，CD的這種性質(zhì)使其在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、化妝品、環(huán)保等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，這使得CGTase的生產(chǎn)研究

2、具有重大意義。 本文通過多因子復(fù)合誘變，獲得一穩(wěn)定高產(chǎn)菌MS-UD5；在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了該菌株的搖瓶產(chǎn)酶條件及5L發(fā)酵罐發(fā)酵條件，并研究了菌株MS-UD5所產(chǎn)的CGTase的一些酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果分述如下： 1．以實(shí)驗(yàn)室保藏的一株嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)IS為研究對(duì)象，首先對(duì)菌體形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行了研究，其產(chǎn)CGTase酶活力為1764.7U/mL，做為后續(xù)誘變的出發(fā)菌株。采用紫外線(

3、UV)、硫酸二乙酯(DES)、He-Ne激光及紫外+硫酸二乙酯復(fù)合誘變對(duì)菌株IS進(jìn)行處理：紫外線照射50s、硫酸二乙酯誘變40min、He-Ne激光輻射25min以及50s UV+30min DES復(fù)合處理分別是最佳誘變劑量，結(jié)合平板快速篩選方法以及突變株產(chǎn)酶性能穩(wěn)定性的分析，得到突變株MS-UD5，產(chǎn)酶活力為5278.8U/mL，是出發(fā)菌株產(chǎn)酶活力的2.99倍。 2．經(jīng)碳、氮源、金屬離子和磷酸鹽篩選試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定菌

4、株MS-UD5產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基配方為(g/L)：玉米粉2.0％，玉米漿6.0％，K<,2>HPO<,4>0.15％，MgSO<,4>．7H<,2>O 0.02％；最適產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為30℃，pH9.8，接種量10％，發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶裝液量為40mL；在得到的最佳產(chǎn)酶條件下180r/min二級(jí)搖瓶發(fā)酵36h產(chǎn)酶活力為5741.6U/mL。 3．在5 L罐發(fā)酵罐中，研究了菌株MS-UD5的發(fā)酵規(guī)律，結(jié)果表明

5、：在菌體對(duì)數(shù)增長期，發(fā)酵液相對(duì)溶氧處于較低的狀態(tài)，發(fā)酵液pH在對(duì)數(shù)增長前期持續(xù)下降，在菌體對(duì)數(shù)增長中期開始回升，菌體產(chǎn)酶呈增長趨勢(shì)；菌體增長進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵液相對(duì)溶氧及pH迅速回升至初始狀態(tài)，菌體產(chǎn)酶接近峰值。根據(jù)發(fā)酵規(guī)律優(yōu)化發(fā)酵條件，通過改善菌體快速增長時(shí)期的氧供應(yīng)不足狀況，可縮短菌體生長到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間，菌體產(chǎn)酶時(shí)間也能相應(yīng)的提前。菌株MS-UD5在5 L罐發(fā)酵罐中發(fā)酵24h產(chǎn)CGTase酶活力達(dá)6032.5U/mL。

6、4．菌株MS．UD5的CGTase的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適pH值為6.0，在pH5.0～10.0范圍內(nèi)基本穩(wěn)定，在70℃以下基本保持穩(wěn)定；Tween 80可使50％酶活喪失；Cu<'2+>、Ag<'+>、A1<'3+>、Fe<'2+>、能使該酶幾乎完全失活； Mg<'2+>、K<'+>、Zn<'2+>、Cr<'3+>、Twcen20和Triton x-100對(duì)酶活性幾乎沒有影響；Mn<'2+>、Ca<'2+>對(duì)酶活性有一定促進(jìn)作用；