美洲商陸抗病毒蛋白-Ⅱ基因的克隆和表達(dá).pdf

1、[目的]:美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweedantiviralproteins，PAPs)是在美洲商陸(phytolaccaamercana)的不同組織或不同生長(zhǎng)階段合成的一類具有酶功能的核糖體失活蛋白(ribosome-inactivatingproteins，RIPs)，有多種類型，即PAP-Ⅰ，PAP-Ⅱ，PAP-Ⅲ，PAP-S，PAP-R，分別來(lái)自春天的葉片、初夏的葉片、晚夏的葉片、種子、根。美洲商陸抗病毒蛋白-Ⅱ(pokew

2、eedantiviralproteinⅡ)，具有RNAN-糖苷酶的活性，能專一地從真核生物核糖體28SrRNA的第4324位和原核生物核糖體23SrRNA的第2600位切下一腺嘌呤，干擾延伸因子EF-2催化GTP的水解，從而阻礙了蛋白質(zhì)的合成。最近的研究表明PAP-Ⅱ蛋白能抑制HIV病毒在內(nèi)的多種病毒，也有研究將其構(gòu)建成免疫毒素，用于殺傷腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室利用基因工程方法，從新鮮的美洲商陸夏季的葉片中成功的克隆了PAP-Ⅱ的基因，插入到

3、原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21中成功地表達(dá)了PAP-Ⅱ蛋白，為進(jìn)一步研究PAP-Ⅱ的抗病毒、抗腫瘤的作用機(jī)理提供研究平臺(tái)。 [方法]:根據(jù)報(bào)道的cDNA序列，設(shè)計(jì)合成兩條引物，在兩條引物上分別添加HindⅢ、NdeⅠ酶切位點(diǎn)，用RT-PCR的方法從夏季的美洲商陸新鮮的葉片中克隆PAP-Ⅱ基因，與T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，經(jīng)過(guò)NdeⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定陽(yáng)性亞克隆，送生工測(cè)序。對(duì)確定含有PAP-Ⅱ基因

4、的陽(yáng)性亞克隆，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ對(duì)陽(yáng)性亞克隆產(chǎn)物雙酶切，目的基因片段切膠回收，與經(jīng)相同酶切的pET-28a-c(+)載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，挑選陽(yáng)性克隆，小量表達(dá)鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒。將含有正確表達(dá)質(zhì)粒pET-PAP-Ⅱ的轉(zhuǎn)化菌BL21(DE3)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體沉淀，重懸超聲破菌，將超聲所得沉淀反復(fù)洗滌，8M的尿素溶解包涵體，透析復(fù)性。復(fù)性蛋白溶液用BBSTNTA樹(shù)脂親和層析純化，經(jīng)SDS-P

5、AGE電泳檢測(cè)，用非放射性基于ELISA方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)復(fù)性純化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A鏈(RTA)在體外對(duì)HIV-1整合酶的抑制活性，用MTT法檢測(cè)PAP-Ⅱ蛋白對(duì)HEP-G2和Hela細(xì)胞毒性。 [結(jié)果]:RT-PCR產(chǎn)物與預(yù)計(jì)的目的片段長(zhǎng)度大小一致。RT-PCR產(chǎn)物與T載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，抽提質(zhì)粒用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切確認(rèn)陽(yáng)性質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序證實(shí)該片段序列與所報(bào)道的序列完全一致。 重組表達(dá)質(zhì)粒pET

6、-PAP-Ⅱ用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳。可見(jiàn)有目的條帶片段，說(shuō)明PAP-Ⅱ的編碼基因已插入pET-28a-c(+)。含重組表達(dá)質(zhì)粒pET-PAP-Ⅱ的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在表達(dá)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)BL21(DE3)細(xì)菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制。表達(dá)后的菌液及菌體超聲破菌后沉淀和上清12％SDS-PAGE電泳，經(jīng)誘導(dǎo)菌液泳道及超聲沉淀泳道均可見(jiàn)一分子量約為35kD的蛋白條帶，而未誘導(dǎo)菌液與超聲上清無(wú)相應(yīng)條

7、帶，這說(shuō)明PAP-Ⅱ蛋白以包涵體形式正確表達(dá)。包涵體反復(fù)洗滌后，用8M尿素溶解，透析復(fù)性所得產(chǎn)物，經(jīng)BBSTNTA樹(shù)脂純化，SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示其純度較高。用非放射性基于ELISA方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)復(fù)性純化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A鏈(RTA)在體外對(duì)HIV-1整合酶有較強(qiáng)的抑制活性，其IC50分別約為303μg/ml，220μg/ml。用MTT法分析PAP-Ⅱ蛋白的生物學(xué)活性，復(fù)性純化后蛋白對(duì)HEP-G2和Hela細(xì)胞有細(xì)胞毒作