條斑紫菜原生質(zhì)體轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、紫菜養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)海藻養(yǎng)殖業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，也是主要的出口創(chuàng)匯海產(chǎn)品。近年來，隨著紫菜栽培業(yè)規(guī)模的逐年擴(kuò)大，對(duì)紫菜優(yōu)良品種的供應(yīng)要求越來越高。紫菜易于養(yǎng)殖，藻體形態(tài)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，細(xì)胞發(fā)育分化易于調(diào)控，酶解紫菜產(chǎn)生原生質(zhì)體及原生質(zhì)體的再生技術(shù)已經(jīng)成熟，易于進(jìn)行分子水平上的研究。因此，開展紫菜基因工程研究，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的手段培育紫菜新品種是十分必要的，也具備現(xiàn)實(shí)可行性。同時(shí)，也有望將紫菜作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)有用的外源蛋白。但是，目前紫菜的轉(zhuǎn)

2、基因研究還處于起始階段，主要是應(yīng)用高等植物中常用的啟動(dòng)子如CaMV 35S等研究報(bào)告基因在紫菜中的瞬間表達(dá)。因此，本論文以條斑紫菜(porphyra yezoensis)的營(yíng)養(yǎng)體純系PY—qingdao1為材料，選擇條斑紫菜的內(nèi)源β一微管蛋白(tubulin)基因的側(cè)翼序列為調(diào)控序列，通過微管蛋白基因及側(cè)翼序列的克隆和分析、表達(dá)載體的構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)化方法的建立等系統(tǒng)地進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究，初步建立其轉(zhuǎn)基因體系。 在本論文的前期研究中，

3、我們選取青島地區(qū)野生條斑紫菜，利用酶解制備原生質(zhì)體進(jìn)行再培養(yǎng)的方法培育了營(yíng)養(yǎng)體純系PY—qingdaol。 根據(jù)真核細(xì)胞β一微管蛋白序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用針對(duì)高GC含量模板的PCR體系，從條斑紫菜PY Qingdao—l的基因組DNA中擴(kuò)增出969bp的B一微管蛋白基因的部分序列，根據(jù)序列測(cè)定分析結(jié)果，設(shè)計(jì)反向PCR引物，并選用一系列在已知序列中不存在的識(shí)別位點(diǎn)的限制型內(nèi)切酶對(duì)于條斑紫菜基因組。DNA進(jìn)行酶切，然后

4、自連，以此為模板，進(jìn)行反向PeR，克隆反向PCR片段并測(cè)序，序列拼接后共得到2799bp，提交到Genbank(AY221630)。其中編碼區(qū)1377bp，GC含量60.57％，比報(bào)道過的一些紅藻的β一微管蛋白基因編碼區(qū)GC含量高，共編碼458個(gè)氨基酸，沒有內(nèi)含子，表現(xiàn)出很強(qiáng)的密碼子偏好性。其上游664bp序列GC含量高達(dá)66.42％，未發(fā)現(xiàn)TATA box，CAM、box等上游調(diào)控序列。其下游758bp的序列中沒有典型的AA[JAM．

5、polyA信號(hào)，只存在一個(gè)CAYTG的高等植物下游的保守序列。將推測(cè)的蛋白質(zhì)全序列與Genbank中其他真核細(xì)胞的β一微管蛋白進(jìn)行序列分析，構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明條斑紫菜與其他紅藻和真菌聚為一個(gè)簇群，而不與包括綠藻在內(nèi)的綠色植物構(gòu)成一個(gè)簇群。 通過PCR分別擴(kuò)增得到含有B一微管蛋白基因編碼區(qū)上游序列663bp和下游序列337bp的兩個(gè)片段，構(gòu)建了瞬間表達(dá)載體pATubGUS，通過電擊法轉(zhuǎn)化條斑紫菜原生質(zhì)體，24小時(shí)后通過分光光度法

6、檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)，且表達(dá)水平超過pBl221，說明β—微管蛋白基因的上游序列有啟動(dòng)子活性，下游序列有終止子的作用。利用上游序列中的酶切位點(diǎn)構(gòu)建瞬間表達(dá)載體pBITub5L、pBITtub5M和pBITub5S分別含有起始密碼子上游663bp、543bp和289bp的序列，結(jié)果證明663bp和543bp序列有啟動(dòng)子活性，而289bp的序列基本無啟動(dòng)子活性。通過PCR擴(kuò)增得到含有終止密碼子下游337bp和431bp的片段，構(gòu)建表達(dá)載體

7、pUCTubGUS和pUCTTubGUS31，瞬間表達(dá)的結(jié)果證明兩者都有終止子活性，而且對(duì)于瞬間表達(dá)水平?jīng)]有明顯的區(qū)別，推測(cè)AAGAAA(終止密碼子下游29l—296)在轉(zhuǎn)錄終止中起到了主要作用，CAYTG(終止密碼子下游416—420)對(duì)于條斑紫菜轉(zhuǎn)錄的終止作用可能影響不大，或3’調(diào)控序列337bp下游載體上類似序列起到相同的作用。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化除用于農(nóng)桿菌天然的宿主，也成功應(yīng)用于絲狀真菌、酵母、甚至人類培養(yǎng)細(xì)胞HeLa細(xì)

8、胞的基因轉(zhuǎn)化中。為在條斑紫菜原生質(zhì)體中建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法，構(gòu)建了農(nóng)桿菌的雙元表達(dá)載體pCAMBIA330lTub5L，和pCAMBIAl302TubCAT。在100 μM乙酰丁香酮(AS)的誘導(dǎo)下，根癌農(nóng)桿菌EHAl05(含有pCAMBIA302TubCAT)的與條斑紫菜原生質(zhì)體共培養(yǎng)48小時(shí)后，進(jìn)行氯霉素抗性篩選和脫菌處理，收集培養(yǎng)物，檢測(cè)到pCAMBIAl302TubCAT、轉(zhuǎn)化組中CAT的活性比對(duì)照組高，說明cat基因有

9、作為選擇標(biāo)記基因的可能性。利用含有pCAMBIA3301或者pCAMBIA3301Tub5L的農(nóng)桿菌EHAl05分別侵染原生質(zhì)體，檢測(cè)到轉(zhuǎn)化組GUS的表達(dá)量高于對(duì)照組，而且pCAMBIA3301轉(zhuǎn)化組顯示出了更高GUS活性。證實(shí)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法可以應(yīng)用于條斑紫菜原生質(zhì)體瞬間表達(dá)的研究。 綜上所述，本論文將反向PCR的技術(shù)首次應(yīng)用于條斑紫菜β—微管蛋白基因及其側(cè)翼序列的克隆，分離了一個(gè)沒有內(nèi)含子的B—微管蛋白基因的序列，并分析

10、其序列的特殊性。首次將內(nèi)源β—微管蛋白基因的側(cè)翼序列用于條斑紫菜原生質(zhì)體的瞬間表達(dá)，得到一個(gè)表達(dá)量明顯高于常用的CaMV 35S啟動(dòng)子的內(nèi)源性啟動(dòng)子。并將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法首次應(yīng)用于條斑紫菜原生質(zhì)體瞬間表達(dá)的研究，建立了簡(jiǎn)便易行的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的條斑紫菜原生質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化的方法，其操作性明顯優(yōu)于現(xiàn)在的條斑紫菜原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法如電擊法、基因槍法等。這些研究為進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因的手段改良紫菜品種，實(shí)現(xiàn)以紫菜為生物反應(yīng)器來大量生產(chǎn)外源蛋白奠定了