條斑紫菜HSP70基因的克隆及功能分析.pdf

1、作為有機(jī)體受到高溫等一些逆境脅迫后大量表達(dá)的熱應(yīng)激蛋白，HSP70(Heat Shockprotein70 KDa)蛋白質(zhì)家族廣泛參與生物體內(nèi)變性蛋白質(zhì)的復(fù)性和降解，以及新生肽的運(yùn)輸、折疊、組裝、定位等多種生理過程。編碼HSP70蛋白家族的基因在藻類中也是普遍存在的，無論是原始的單細(xì)胞藻類還是多細(xì)胞的大型藻類，HSP70基因在藻類適應(yīng)環(huán)境的過程中起了極其重要的作用。但有關(guān)HSP70在海藻抗逆環(huán)境脅迫中的作用一直未得到深入研究。以大型經(jīng)濟(jì)

2、海藻條斑紫菜的絲狀體為實(shí)驗(yàn)材料，克隆得到一條636bp的HSP70基因的EST序列，然后采用3'RACE和5'RACE PCR技術(shù)，克隆得到完整的HSP70基因。該基因序列全長為2221bp，預(yù)測的HSP70基因的ORF為1992bp，共編碼663個氨基酸，5'UTR長度為119 bp，3'UTR長度為110bp，命名為PyHSP70。保守結(jié)構(gòu)域分析表明該基因含有ATPase活性的NBD(nucleotide binding domai

3、n)保守結(jié)構(gòu)域。理化性質(zhì)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子量為71.7KDa，等電點(diǎn)為4.93，是穩(wěn)定蛋白質(zhì)。將PyHSP70基因與表達(dá)載體pET-28a連接，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21進(jìn)行表達(dá)，提取得到融合蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳后顯示PyHSP70分子量約為71KDa，與預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量相接近。大量誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)并進(jìn)行純化，BCA(bicinchoninic acid)法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定，結(jié)果顯示濃度為1mg/m

4、L。ATPase活性檢測顯示隨著蛋白質(zhì)添加量的增加，反應(yīng)體系中ATP含量減少，表明HSP70蛋白具有ATPase活性。
　　測定大腸桿菌在高溫脅迫下和正常條件下的生長曲線，結(jié)果顯示高溫條件下轉(zhuǎn)pET-28a/PyHSP70菌株的生長情況明顯好于對照組，說明HSP70基因過表達(dá)提高大腸桿菌的耐高溫能力。高溫誘導(dǎo)條斑紫菜HSP70基因的表達(dá)，在熱誘導(dǎo)3～6 h，基因表達(dá)量達(dá)到高峰，顯示了該基因的表達(dá)與植物體耐熱性相關(guān)聯(lián)。
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