四個(gè)腸桿菌植酸酶基因的克隆、表達(dá)及性質(zhì)研究.pdf

1、植酸酶(肌醇六磷酸酶)是能夠?qū)⒅菜岱纸鉃榧〈己蜔o(wú)機(jī)磷的一類酶的總稱,在飼料工業(yè)上的應(yīng)用可以提高單胃動(dòng)物對(duì)飼料中磷的利用率,降低植酸磷對(duì)環(huán)境的污染,并降低飼料成本.此外植酸酶還可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品工業(yè).微生物是植酸酶的主要來(lái)源,從微生物中篩選新的、性質(zhì)優(yōu)良酶蛋白是植酸酶研究的一個(gè)重要方向. 本研究根據(jù)HAP類植酸酶的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,從腸桿菌科微生物Hafnia alvei B125、Dickeya dadantii B187

2、、Dickeya paradisiaca B188菌中擴(kuò)增出植酸酶基因片段,利用TAIL-PCR的方法得到了這三個(gè)基因的完整序列,分別命名為B125appA,B187appA,B188appA.此外根據(jù)鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)全基因組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR克隆得到另外一個(gè)植酸酶基因Y1appA.克隆的四個(gè)植酸酶基因之間的核苷酸一致性最高為75﹪(B187appA與B188appA),最低為48﹪(B188ap

3、pA與B125appA,B188appA與Y1appA). 通過(guò)序列比對(duì)分析,B125appA編碼蛋白與變形肥桿菌(Obesumbacterium proteus)來(lái)源的植酸酶氨基酸序列一致性為95﹪,雖然二者一致性較高,但它們?cè)谧钸m溫度和熱穩(wěn)定性方面有較大的差異.B187appA和B188appA編碼蛋白與軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)中一個(gè)假定的磷酸酶蛋白氨基酸序列一致性分別達(dá)到53﹪和52﹪,與肺炎

4、克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)來(lái)源的植酸酶氨基酸序列一致性分別為50﹪和49﹪.說(shuō)明克隆得到的B187appA,B188appA為兩個(gè)新的植酸酶基因.YlappA編碼蛋白與中間型耶爾森氏菌(Yersinia intermedia)來(lái)源的植酸酶氨基酸序列一致性為81﹪,二者在性質(zhì)上有所差異. B125appA,B187appA,B188appA基因均在大腸桿菌中得到表達(dá),YlappA基因在酵母中得到表達(dá),

5、表達(dá)的植酸酶具有生物學(xué)活性.純化四個(gè)酶并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析.B125r-APPA最適pH值為4.5,最適溫度為60℃,pH穩(wěn)定性好,從pH2.0到pH10.0剩余酶活均在80﹪以上,比活性為356.7 IU/mg,K<,m>為0.49 mmol/L,V為238 IU/mg. B187r-APPA與B188r-APPA最適溫度均為55℃.都具有較好的pH穩(wěn)定性,從pH4.0到pH9.0剩余酶活性為60﹪,其中從pH4.

6、5到pH7.5剩余酶活性在100﹪.二者的最適pH值有所區(qū)別,B187r-APPA為5.5,B188r-APPA為4.5和5.5.B187r-APPA的比活性為642.64IU/mg,B188r-APPA的比活性為768.8 IU/mg.B187r-APPA的K<,m>為0.249 mmol/L,V<,max> 為833 IU/mg.B188r-APPA的K<,m>為0.399 mmol/L,V<,max>為666 IU/mg. YIr

7、-APPA具有較高的比活性,達(dá)到2346.09 IU/mg,是本研究四個(gè)酶中最高的.酶的最適pH值為4.5,酶在酸性條件下活性較高,在pH2.0時(shí)仍有80﹪的活性.這在細(xì)菌來(lái)源的植酸酶中不多見(jiàn).最適溫度為55℃.酶的pH穩(wěn)定性很好,從pH2.5到pH10.0剩余酶活維持在80﹪以上.K<,m>為0.208 mmol/L,NV<,max>為4403.35 IU/mg. 據(jù)我們所知,目前尚無(wú)關(guān)于Hafnia與Dickeya屬中發(fā)現(xiàn)