高特異性碳納米生物傳感器快速檢測沙門氏菌的研究.pdf

1、食源性病原菌是當今世界最為普遍的問題之一。微生物食品中毒可以由細菌、病毒、真菌以及原生生物引起，其中絕大部分的細菌性感染都是由沙門氏菌引起的。目前，由沙門氏菌所引發(fā)的禽蛋肉產(chǎn)品的污染以及食物中毒事件已成為制約國民經(jīng)濟發(fā)展、危害人類健康的嚴重食品安全問題。隨著人們對食品安全問題關(guān)注度的不斷增長，對發(fā)展快速、準確、靈敏、高效的食品安全檢測技術(shù)提出了更高的要求。然而目前的傳統(tǒng)檢測方法存在耗時耗力、價格昂貴、操作繁瑣、靈敏度不高、特異性不強等局

2、限性，已不能滿足沙門氏菌快速檢測技術(shù)發(fā)展的新要求。因此，建立一種簡單、高效、快速、靈敏的檢測手段來監(jiān)控沙門氏菌就顯得尤為重要。碳納米管基于其獨特的化學、電學、光學、力學性質(zhì)在生物傳感器以及藥物傳遞等方面有著非常廣泛的應用前景。尤其是近些年來，碳納米管作為一種廣譜性的熒光猝滅劑已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注，成為最具發(fā)展前景的納米材料之一。本論文在對碳納米管性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子探針構(gòu)建了基于生物功能化的碳納米管生物傳感器對沙門氏菌進行檢測

3、;此外，一種類似于碳納米管的碳材料—石墨烯也被應用于檢測沙門氏菌中ATP的含量。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的傳感器具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。最后，鑒于沙門氏菌形成生物菌膜后難以清除和難以治療的現(xiàn)狀，本論文篩選出一種抑制型適配體用以控制沙門氏菌菌膜形成，從而拓展了適配體的應用范圍?；谝陨锨闆r，具體研究內(nèi)容如下:
　　(1)檢測含毒力島SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌。利用碳納米管作為載體和熒光猝滅劑，分子信標作為識別元件，建立了一

4、種全新的快速檢測含毒力島SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌的方法。在本檢測方法中，羧基修飾的碳納米管與一端氨基修飾的分子信標在EDC/NHS的作用下脫水結(jié)合形成生物功能化的碳納米管。在沒有靶標的情況下，由于DNA與碳納米管的雙重猝滅效應，熒光分子柔紅霉素發(fā)生熒光猝滅;當加入靶標后，由于靶標與環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合導致分子信標結(jié)構(gòu)崩解，插入莖狀結(jié)構(gòu)中的柔紅霉素釋放出來，使得熒光值增強。而加入錯配堿基序列，柔紅霉素熒光值增強的信噪比遠低于靶標。實驗結(jié)果表明

5、，通過檢測柔紅霉素熒光值的增強可以對含有SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌進行定量檢測，而且此方法具有較高的靈敏性和特異性。在本檢測體系中，靶標的濃度與柔紅霉素熒光值的增強在0.2-0.7μM的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，并且目標DNA的檢測下限為50nM。
　　(2)檢測甲型副傷寒沙門氏菌的研究。通過酸水解法提取甲型副傷寒的鞭毛蛋白，并以其為靶標分子，經(jīng)過14輪的SELEX篩選，篩選出能夠高親和性、高特異性結(jié)合鞭毛蛋白的適配體群。利用DN

6、AMAN軟件分析其一級結(jié)構(gòu)的相似性并進行二級結(jié)構(gòu)的預測，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的相似性以及一級結(jié)構(gòu)的重復性，將所選的適配體分為4個家族。從4個家族中各挑選出1條適配體并對其進行親和力測試，通過比較Kd值，最終篩選出一條最佳的適配體。將該適配體截去部分引物序列并修飾上FITC，同時在另一端結(jié)合上一段DNA酶序列，并將該探針非共價結(jié)合到碳納米管上，從而設(shè)計出一條能夠通過雙重信號檢測甲型副傷寒沙門氏菌的功能化核酸探針。實驗結(jié)果表明，通過檢測熒光值的增加

7、以及吸光度的增加可以對牛奶樣品中的甲型副傷寒沙門氏菌進行定量檢測，在本檢測體系中，用熒光信號以及吸光度所測出的最低檢測下限分別為105CFU/mL和106CFU/mL。該方法同時利用兩種信號來檢測靶標物質(zhì)，極大的提高了檢測的準確性和可靠性，降低了假陽性信號產(chǎn)生的可能性。這一檢測方法不僅可以用于檢測甲型副傷寒沙門氏菌，也為其它細菌以及其它物質(zhì)的快速檢測提供了一種新的思路。
　　(3)基于氧化石墨烯的非標記性熒光適配體傳感器快速檢測A

8、TP的研究。實驗首先證明了該方法的可行性，結(jié)果表明，在只加入信號探針互補鏈的情況下，熒光信號并不會增強;只有在同時加入信號探針互補鏈和ATP的條件下熒光信號才會增強。由此證明，熒光信號的增強只與加入ATP的多少有關(guān)，因此該體系可以用來定量檢測ATP。由檢測結(jié)果可知，當ATP的濃度從1nM到800nM變化，對應的熒光強度隨濃度的增加而增加，其檢測下限可達1nM，而且F/F0在10nM到700nM之間呈良好的線性關(guān)系。體系還對檢測ATP的特

9、異性作出了探討，將ATP的類似物UTP、GTP、CTP作為對照，由檢測結(jié)果可知該適配體傳感器對ATP分子的檢測具有很強的特異性。相比于其它傳統(tǒng)的檢測方法，該分子識別技術(shù)對ATP的檢測，不僅靈敏度高，特異性強，而且操作簡單，成本低廉，穩(wěn)定性好，為其它檢測方法的開發(fā)和利用打下了堅實的基礎(chǔ)。
　　(4)適配體控制細菌菌膜形成的研究。以豬霍亂沙門氏菌為靶標，經(jīng)過14輪的SELEX篩選，篩選出能夠特異性識別豬霍亂沙門氏菌的適配體群，并在第十

10、輪和第十一輪分別用甲型副傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌進行反篩，以提高篩選的特異性。經(jīng)親和力檢測后，確定一條最佳的適配體，將該適配體生物素修飾后并結(jié)合鏈酶親和素修飾磁珠用以垂釣豬霍亂沙門氏菌表面標記分子。經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，該適配體特異性結(jié)合的靶標為鞭毛蛋白。由鞭毛介導的趨向運動和起始粘附在早期細菌生物膜的形成中至關(guān)重要，基于以上事實，本研究開發(fā)出能抑制鞭毛運動進而控制細菌生物膜形成的功能化適配體。實驗結(jié)果表明，經(jīng)抑制性實驗、熒光倒置顯微鏡和原