沙門氏菌屬特異性靶點基因的篩選與PCR檢測方法的建立.pdf

1、沙門氏菌是一種最為常見的食源性致病菌。在世界范圍內(nèi)，由沙門氏菌導(dǎo)致的食源性疾病一直位于細(xì)菌性食物中毒的首位。目前，食品安全檢測部門仍采用傳統(tǒng)的分離鑒定方法來檢測沙門氏菌，耗時長且手段繁瑣，在實際突發(fā)疫情檢測時，不能滿足檢測的需要?；诰酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)的快速檢測方法由于其快速、靈敏度高、簡便的特性，更能適應(yīng)致病菌快速檢測的需要。PCR檢測方法的特異性與靈敏度主要取決于相應(yīng)檢測靶點的選擇。目前，沙門氏菌PCR方法所用的檢測靶點，大多數(shù)是國外學(xué)

2、者在2000年之前發(fā)掘的，很多靶點在使用過程中出現(xiàn)了非特異性擴增和靈敏度不高的情況。
　　本研究利用全基因組在線比對的方法，新發(fā)掘了沙門氏菌屬特異性片段，經(jīng)過篩選與評價，選擇性能較好的片段3335471建立了沙門氏菌快速檢測方法，取得的主要結(jié)果如下:
　　1、沙門氏菌屬特異性靶點基因的篩選通過在線BLAST程序比對，發(fā)掘出98個檢測沙門氏菌屬的特異性片段。對GeneID:3334000～3337003的25個片段分別設(shè)計25

3、個引物并驗證其特異性，得到8對特異性較好的引物和片段，在13株沙門氏菌中擴增均能得到相應(yīng)條帶，在16株非沙門氏菌中無擴增條帶，與對照基因invA的引物139-141相比，特異性較好。經(jīng)過檢測靈敏度的評價，靈敏度最優(yōu)的引物為SC8(3335583)和SC9(3335471)，以豬霍亂沙門氏菌ATCC13312為試驗菌株，引物SC8和SC9的基因組DNA檢測靈敏度分別為12.3fg/μL和1.23fg/μL，細(xì)菌純培養(yǎng)檢測靈敏度均為720c

4、fu/mL，兩者均優(yōu)于對照引物139-141。
　　2、添加擴增內(nèi)標(biāo)的沙門氏菌普通PCR檢測方法的建立和PCR凍干反應(yīng)液的研究針對第二章篩選得到的沙門氏菌特異性靶點3335471和引物SC9，建立了普通PCR檢測方法。采用復(fù)合引物法構(gòu)建擴增內(nèi)標(biāo)，經(jīng)特異性檢驗，在沙門氏菌中可以擴增出目標(biāo)條帶與內(nèi)標(biāo)條帶;在非沙門氏菌中只擴增內(nèi)標(biāo)條帶，說明PCR反應(yīng)未受抑制。對內(nèi)標(biāo)添加量優(yōu)化，添加濃度為365拷貝/μL的擴增內(nèi)標(biāo)時，擴增內(nèi)標(biāo)能發(fā)揮作用且

5、不影響檢測靈敏度。將PCR反應(yīng)液和引物SC9經(jīng)過冷凍干燥，制成凍干粉狀，使用時只需添加模板和水，減少了PCR反應(yīng)中因多次加樣帶來的污染。凍干反應(yīng)液可以在-20℃保存三個月，對檢測效果沒有影響。在人工污染牛奶樣品試驗中驗證建立的普通PCR檢測方法和PCR凍干反應(yīng)液的的檢測能力，結(jié)果表明，當(dāng)初始接種量低至7cfu/10mL樣品時，普通PCR和PCR凍干反應(yīng)液只需8小時，即可檢出，與國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法結(jié)果吻合。
　　3、沙門氏菌熒光定量P

6、CR檢測方法的建立選取第二章篩選得到的特異性靶點3335471，設(shè)計引物SC9-62，建立SYBRGreenI實時定量檢測方法。同時，利用復(fù)合引物法構(gòu)建擴增內(nèi)標(biāo)，在13株沙門氏菌和16株非沙門氏菌中特異性較好。對內(nèi)標(biāo)添加量進行優(yōu)化，內(nèi)標(biāo)濃度為425拷貝/μL時能準(zhǔn)確指示假陰性且不影響反應(yīng)的檢測靈敏度。以豬霍亂沙門氏菌ATCC13312為目標(biāo)菌株，評價檢測靈敏度，靈敏度達到1.23fg/μL且數(shù)據(jù)重復(fù)性較好.人工污染牛奶樣品中的沙門氏菌，