腸炎沙門氏菌種特異性FQ-PCR建立及在闡明其侵染機(jī)制研究中的應(yīng)用.pdf

1、本研究分為三部分： 1.舾種特異性FQ-PCR方法的建立 腸炎沙門氏菌(Sallmonellaenteritidis，SE)感染是一種重要的人畜共患病，本文根據(jù)GenBank登錄的SE種特異性DNA序列，設(shè)計合成了一對能特異性擴(kuò)增130bpDNA片段的引物及相應(yīng)的TaqMan探針，首次建立了SE種特異性的實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(FQ-PCR)診斷方法。該方法只能特異性擴(kuò)增SE，而對豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、甲型

2、副傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、鴨沙門氏菌、雞沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、禽多殺性巴氏桿菌、鴨源大腸桿菌等常見沙門氏菌和常見感染鴨的致病菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；該法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-3.389X+44.276，相關(guān)系數(shù)為1.000，PCR循環(huán)效率為97.3％；檢測SE標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的靈敏度為4copies/μL，檢測SE細(xì)菌數(shù)的敏感性為6CFU/μL，重復(fù)性差異系數(shù)為1.8％。分別應(yīng)用該技術(shù)和傳統(tǒng)細(xì)菌分離法檢測人工感染死

3、亡雛鴨的心、肝、腦和直腸糞便，結(jié)果顯示兩種方法對心、肝、直腸糞便的陽性檢測結(jié)果符合率為100％，而FQ-PCR對腦的陽性檢測率極顯著(P＜0.01)高于細(xì)菌分離。研究結(jié)果表明，該方法快速、靈敏、特異、重復(fù)性好且能實(shí)時定量檢測，可用于SE分離鑒定、SE感染疑似病例檢測、SE體內(nèi)動態(tài)分布規(guī)律研究及其分子流行病學(xué)調(diào)查。 2.在SE實(shí)驗(yàn)感染雛鴨侵染機(jī)制研究中的應(yīng)用 應(yīng)用建立的FO-PCR方法對經(jīng)皮下、口服和滴鼻途經(jīng)人工感染SE雛

4、鴨組織器官的檢測結(jié)果表明： 經(jīng)皮下接種該菌后最早可在2h內(nèi)從血液中檢測到，4h能在心、肝和脾中檢測到；8h在腎、空腸和回腸檢測到陽性結(jié)果；12h除胸腺呈陰性外，其余組織均為陽性；24-36h之間各組織器官均能檢測到SE且含菌量達(dá)到最高，統(tǒng)計顯示，心、肝臟、脾臟、腎臟、回腸、空腸和盲腸的陽性拷貝數(shù)高于其它部位3-6個數(shù)量級，差異極顯著；皮下感染的雛鴨在36h后全部死亡。 通過口服接種結(jié)果顯示，8h在空腸和回腸最早被檢測到，

5、12h可在除肺、胰、法氏囊、胸腺、腦外的所有組織器官中被檢測到，但拷貝數(shù)低于皮下組1-2個數(shù)量級；24h腦組織開始出現(xiàn)陽性結(jié)果；24-36h后全部被檢組織器官呈陽性反應(yīng)且達(dá)到最高峰；同樣地，心、血、肝臟、脾臟、腎臟、回腸、空腸和盲腸的陽性拷貝數(shù)明顯高于其它部位。48h后含菌量開始下降2-3個數(shù)量級或不能被檢測到陽性結(jié)果，然而該菌能在脾、空腸、回腸和盲腸中持續(xù)到9d仍能被檢測到。 滴鼻組中感染鴨SE的DNA拷貝數(shù)顯著低于前兩種感染

6、途徑。2h在肺中最早檢測到，4h后能在血液中被檢測到，8h心、肝、脾也呈陽性反應(yīng)；12h除胸腺、食道、腦外均呈陽性反應(yīng)；24h腦開始出現(xiàn)陽性結(jié)果；36h后能在所有樣品中檢測到并達(dá)到高峰，但其陽性拷貝數(shù)顯著低于前兩種接種方式。9d后，只能在脾臟、空腸、回腸和盲腸檢測到SE。 3.在SE實(shí)驗(yàn)感染小鼠侵染機(jī)制研究中的應(yīng)用 通過口服感染結(jié)果顯示，8h在空腸和回腸最早被檢測到，12h可在除肺、胰、腦外的所有組織器官中被檢測到，但拷

7、貝數(shù)低于皮下組1-2個數(shù)量級；24h腦組織開始出現(xiàn)陽性結(jié)果；24-36h后全部被檢組織器官呈陽性反應(yīng)且達(dá)到最高峰；同樣地，心、血、肝臟、脾臟、腎臟、回腸、空腸和盲腸的陽性拷貝數(shù)明顯高于其它部位。48h后含菌量開始下降1-2個數(shù)量級或不能被檢測到陽性結(jié)果，然而該菌能在脾、空腸、回腸和盲腸中持續(xù)到9d仍能被檢測到。 SE經(jīng)三種途徑感染后的共同特點(diǎn)是：腸道中以空腸和回腸的含菌量最高，且能持續(xù)存在9d而不被機(jī)體清除；主要內(nèi)臟器官中以肝、