樹豆內酯A調節(jié)Wnt-β-catenin-runx-2信號通路促進人骨髓間充質干細胞成骨分化的作用研究.pdf

1、骨質疏松癥是多種原因引起的一種全身骨骼代謝性疾病，以骨量減少、骨組織微細結構受損為主要特征，導致脆性骨折的風險增加。骨組織形成的減少、骨質吸收增多是骨質疏松的主要病因。Wnt/β-catenin/Runx-2信號轉導途徑調節(jié)成骨細胞的分化、生長、凋亡等過程，是骨代謝過程中重要的信號系統(tǒng)。
　　目的:
　　本組前期從具有增強骨丟失小鼠骨密度的樹豆植物藥用脂溶性部位中分離到了具有促成骨細胞分化活性、增強小鼠骨密度的一種作為植物藥

2、用部位提取蔗類單體成分樹豆內酯A(CLA)。為了探討CLA促進成骨的分子機制，本實驗以人骨髓來源的間充質干細胞(hBMSCs)為模型，探討CLA對定向誘導的hMSCs成骨分化的影響，具體探討其對成骨分化信號通路的影響，為CLA用于治療骨質疏松癥的藥物開發(fā)提供實驗依據。
　　方法:
　　(1)CLA對hMSCs增殖的作用:生長狀態(tài)良好的第4-6代hBMSCs細胞和不同濃度CLA在生長培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)48h或72h。CCK-8法

3、檢測細胞活力，評價CLA對細胞增殖的影響;(2)CLA對hBMSCs成骨分化作用:生長狀態(tài)良好的hBMSCs第5代細胞在不同濃度CLA存在下，用成骨分化培養(yǎng)液對hBMSCs進行成骨分化誘導培養(yǎng)，在誘導的周期內分別對細胞進行堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色及茜素紅S染色，觀察其成骨活性和鈣結節(jié)形成情況，判斷CLA對hBMSCs成骨分化的作用;(3)CLA對hBMSCs成骨分化過程中Wnt/β-catenin

4、/runx-2信號通路的影響:取第5代生長狀態(tài)良好的hBMSCs，分別在不同濃度CLA存在下進行成骨分化誘導培養(yǎng)，以未添加CLA的誘導組為陽性對照組，以未進行成骨誘導的細胞為陰性對照組;分別在誘導培養(yǎng)第24h，3d、6d、9d和12d提取總RNA，實時熒光定量RT-PCR法檢測成骨前期轉錄因子Runx-2與Osterix，及Wnt/β-catenin經典信號通路的Wnt-3a，Wnt-5a，Wnt-10b，低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6

5、(LRP-5/6)，F(xiàn)rizzled(Fz)共受體，以及β-catenin基因的表達量。在誘導培養(yǎng)的第15d提取總蛋白，蛋白印跡法(WesternBlot)檢測Runx-2、β-catenin，Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)，骨形態(tài)學蛋白(BMP-2)，骨橋蛋白(OPN)的表達水平。
　　結果:
　　(1)CLA在10μmol/L及以下濃度作用于hBMSCs48，72h，不影響細胞的增殖，在20μmol/L時對細胞表現(xiàn)出

6、一定的抑制作用;(2)在誘導hBMSCs成骨分化過程中，堿性磷酸酶與茜素紅S染色結果顯示，CLA的三個劑量（4，2和1μmol/L）均有良好的促成骨分化作用，但是CLA4μmol/L與2μmol/L兩個劑量的作用效果沒有明顯的量效關系;(3)實時熒光定量RT-PCR結果顯示:與未誘導分化組相比，誘導分化各組的細胞在分化周期第24h，3d、6d、9d和12d均檢測到Wnt-3a，Wnt-10b，LRP-5，β-catenin，Runx-2

7、與Osterix基因mRNA水平有明顯上升;與誘導對照組相比，CLA三個劑量(2，1，0.5μmol/L)對這些基因的表達在第24h出現(xiàn)明顯的促進作用，而在第3天或者6天各基因表達量均達到峰值，并出現(xiàn)明顯的量效關系。第6天后，各基因表達量均出現(xiàn)表達量下降的趨勢，并隨著誘導時間的加長，趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，藥物作用無明顯量效關系;(4)蛋白印跡法(WesternBlot)結果顯示:在誘導分化第15天，與未分化相比，誘導分化組的Runx-2，β-