固定CO2富油微藻的選育及基因轉化藻株的構建研究.pdf

1、人類工業(yè)文明快速發(fā)展，不可避免地排放各種廢氣與污水，污染人類賴以生存的環(huán)境。作為溫室氣體的主要成分，CO2的減排勢在必行，而利用微藻固碳被認為是降低 CO2水平最環(huán)保安全和可持續(xù)的方式。微藻技術用于煙道氣CO2固定需要克服的最大難題是提高微藻固定CO2的能力，因此最為重要的是獲得十分優(yōu)質的藻種，同時，藻株既要具備繁殖快生長快、含油量高、容易回收的生物特性，同時還要具備高耐受性，可以在煙道氣中有毒，有塵，高溫的環(huán)境下生存；同時獲得更多的副

2、產物，比如微藻生物質。微擬球藻Nannochloropsis是真核單細胞藻類，具有很高的光合作用效率、生物量和油脂含量。目前，對有些微擬球藻株已建立了成熟的培養(yǎng)體系，多個藻株的全基因組序列業(yè)已公布，在微藻產油工業(yè)化應用研究中微擬球藻屬已作為模式研究藻種被國內外研究人員廣泛關注。因此，篩選富油微擬球藻耐受高濃度CO2的藻株，及通過基因工程的手段改良富油微藻的耐受高CO2的能力就變得非常有意義。
　　本研究采用光生物反應器以高濃度CO

3、2條件對6株海洋微擬球藻進行了篩選及培養(yǎng)，分析發(fā)現(xiàn)海洋微擬球藻 N.oceanica、鹽生微擬球藻 N.salina和眼點微擬球藻N.oculata這3株微藻可耐受5％CO2，生長良好。N.salina在5%CO2條件時，TAG含量最高，大于10%CO2條件生長受到抑制。在通入CO2條件下培養(yǎng)富含 TAG的淡水湖泊微擬球藻，考察其對亞硝態(tài)氮的耐受性，結果表明盡管該藻不能耐受很高濃度的CO2(>2%)，但該藻可以在含高濃度亞硝態(tài)氮(1mM

4、 NaNO2)的培養(yǎng)液中正常生長，也是一個在工業(yè)上有應用前景的優(yōu)良藻株。在本研究中，我們克隆得到微綠球藻屬的已定種的所有藻株微管蛋白β-tubulin啟動子區(qū)域，并通過電擊轉化方法成功轉化這個屬的所有5個海水種的6株微藻。另外，建立了基于PCR擴增的雙鏈DNA片段(PCR產物)的轉化體系，得到比基于線性化的質粒轉化更高的轉化效率(10.7?61.2×10-6，1.5?13倍)。成功使用含有非抗性選擇的GUS基因和僅含有選擇標記盒的質粒對

5、鹽生微擬球藻N.salina進行共轉化，共轉化率超過50%。成功構建N.gaditana、N.salina及兩株N.oceanica共4株微藻的，分別含有各自內源β-tubulin啟動子及碳酸酐酶CA基因的RNAi片段的質粒載體 pks-TUBp-CAH2-RNAi，并對4株微擬球藻進行遺傳轉化，初步檢測證實抗性基因已經(jīng)插入陽性轉化子的基因組中， RT-PCR結果提示碳酸酐酶CA基因表達下調，Western Blot分析顯示碳酸酐酶蛋白