組蛋白去乙?；冈谥夤芟虏∵^程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:支氣管哮喘是一種常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病，其病理變化主要為氣道炎癥、氣道重塑及氣道高反應(yīng)。目前哮喘治療仍以緩解癥狀和控制炎癥為主，但哮喘長期反復(fù)發(fā)作，會導(dǎo)致支氣管平滑肌增厚、上皮下纖維化以及膠原沉積等，最終出現(xiàn)氣道重塑或塌陷等一系列不可逆性改變。因此，研究哮喘致病機(jī)制，尋求哮喘治療的新靶點是目前迫切需要解決的問題。組蛋白去乙?；?Histone Deacetylases，HDACs)主要負(fù)責(zé)調(diào)控組蛋白和非組蛋白的乙?；揎椷^程，在

2、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)功能上具有重要作用。研究表明HDACs與哮喘發(fā)病密切相關(guān)，抑制HDACs能夠有效緩解哮喘相關(guān)癥狀，但截至目前為止，HDACs各成員在哮喘致病過程中的表達(dá)形態(tài)究竟發(fā)生了怎樣的變化？其中起關(guān)鍵作用的HDACs成員有哪些？它們調(diào)控的關(guān)鍵組蛋白作用靶點是什么？目前尚不清楚。本次研究中我們將以慢性哮喘小鼠為研究對象，從多個角度分析HDACs家族成員(HDAC1-10)在哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)形態(tài)，明確在哮喘致病過程中HDACs

3、各成員的表達(dá)變化以及其中起關(guān)鍵作用的HDACs成員。并進(jìn)一步通過乙酰化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)的方法找到組蛋白去乙?；敢种苿℉istone Deacetylase Inhibitors，HDACIs）治療哮喘的關(guān)鍵作用靶點和作用機(jī)制。最后通過選取特異性HDACIs干預(yù)哮喘小鼠明確各HDACs成員在哮喘致病中所起的作用，為選取特異性HDACIs用于哮喘治療提供理論依據(jù)。
　　研究方法:本次研究分為三部分，第一部分選取慢性哮喘小鼠為研究對象

4、，從表達(dá)分布和表達(dá)量兩個方面探討哮喘致病過程中HDACs家族成員表達(dá)形態(tài)的變化，明確在哮喘致病過程中起關(guān)鍵作用的HDACs成員;第二部分主要通過生物數(shù)據(jù)分析從乙?；啃揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)角度探討哮喘致病過程中HDACs的作用靶點，從分子水平上闡明哮喘發(fā)病時組蛋白乙?；揎椢稽c乙?；降母淖?，明確哮喘治療與組蛋白乙?；揎椫g的關(guān)系。第三部分選取特異性HDACIs干預(yù)哮喘小鼠，從氣道炎癥、氣道重塑以及氣道高反應(yīng)三個方面評估不同HDACIs治

5、療哮喘時的作用特點，明確不同HDACs成員所起的關(guān)鍵作用。
　　1.慢性哮喘小鼠肺組織中HDACs表達(dá)形態(tài)研究
　　1.1、動物分組和慢性哮喘模型制備6-8周SPF級BALB/C雌性小鼠，隨機(jī)分為正常組和哮喘組，12只/組。于實驗第0、7、14天，哮喘組小鼠予以氫氧化鋁凝膠(2mg)和OVA(20ug)致敏。末次致敏1周后，應(yīng)用超聲霧化裝置(3ml/min)進(jìn)行OVA(20mg/ml)霧化8周，3次/周，30min/次。正常

6、組小鼠均以生理鹽水替代OVA處理。
　　1.2、肺功能激發(fā)實驗?zāi)┐渭ぐl(fā)實驗24h后，采用Emka小動物無創(chuàng)肺功能系統(tǒng)檢測不同濃度氯化乙酰甲膽堿刺激后，各組小鼠的氣道增強(qiáng)呼氣間歇(EnhancedPause，Penh)值，用于評估氣道高反應(yīng)性。
　　1.3、病理標(biāo)本的制備及染色提取小鼠左側(cè)肺組織，石蠟包埋并切片后行HE染色。
　　1.4、免疫組化染色采用SP法，對左側(cè)肺組織切片標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，檢測HDACs成員(H

7、DAC1-10)在肺組織中的表達(dá)分布。
　　1.5、 Western Blotting提取各組小鼠右側(cè)肺組織蛋白，檢測各HDACs成員(HDAC1-10)的表達(dá)水平。
　　2.慢性哮喘小鼠肺組織中HDACs作用靶點探討
　　2.1、動物分組和慢性哮喘模型制備6-8周SPF級BALB/C雌性小鼠，隨機(jī)分為正常組和哮喘組，12只/組。哮喘建模方法同前。
　　2.2、蛋白提取與肽段制備末次激發(fā)實驗24h后獲取小鼠肺組織

8、，液氮研磨法提蛋白，胰酶酶切獲取肽段。
　　2.3、肽段標(biāo)記與分級將肽段采用同位素標(biāo)記，采用Agilent300Extend C18色譜柱對肽段進(jìn)行分級，分級后樣品低溫真空抽干后備用。
　　2.4、乙?；亩蜪P富集肽段復(fù)溶，采用乙?；胖榉跤?，提取乙?；揎椂嚯?。
　　2.5、質(zhì)譜分析采用EASY-nLC1000 ultra-performance液體系統(tǒng)對乙?；亩芜M(jìn)行分級，之后采用Thermo Scientifi

9、cTM Q ExactiveTM Plus對分級后的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。
　　2.6、質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫及生物信息分析采用MaxQuant結(jié)合Andromeda searchengine(v.1.4.1.2)軟件對質(zhì)譜所得數(shù)據(jù)在UniProt_Mus小鼠的數(shù)據(jù)庫以及反庫中檢索，檢索結(jié)果可信度檢驗后，于UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Gene Ontology(GO)注釋，富集分析，最后采用Motif-x分析乙酰化修飾位點附近的氨基酸序列

10、。
　　2.7、 Western Blotting提取各組小鼠肺組織蛋白，檢測肺組織中H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K27ac、H3K36ac位點乙酰化修飾水平，對質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行驗證。
　　3.特異性HDACIs對慢性哮喘小鼠的干預(yù)作用
　　3.1、動物分組與治療6-8周SPF級BALB/C雌性小鼠72只，隨機(jī)分為6組，12只/組:正常組（A組）、哮喘組（B組）、地塞米松組（C組）、Givinosta

11、t組(D組)、TubastatinA Hcl（E組）、PCI-34051（F組）。哮喘建模方法同前。地塞米松（2.0mg.kg-1，腹腔注射）、Givinostat（0.5mg.kg-1，灌胃口服）、TubastatinAHcl（0.5mg.kg-1，腹腔注射）和PCI-34051（0.5mg.kg-1，腹腔注射），分別于每次激發(fā)試驗前30min給藥。正常組小鼠均以生理鹽水替代OVA及藥物處理。
　　3.2、肺功能激發(fā)實驗?zāi)┐渭ぐl(fā)

12、實驗24h后，采用Emka動物肺功能檢測系統(tǒng)檢測不同濃度氯化乙酰甲膽堿刺激后，各組小鼠的氣道Penh值，用于反應(yīng)氣道高反應(yīng)性。
　　3.3評估支氣管肺泡灌洗液(Broncho-Alveolar Lavage Fluid，BALF)中炎癥水平末次激發(fā)實驗24h后，行支氣管肺泡灌洗術(shù)收集BALF，離心取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組小鼠BALF中IL-4、IL-5、TGF-β1和IFN-γ表達(dá)水平。重懸細(xì)胞沉淀并甩片，

13、瑞特-吉姆薩染色，計數(shù)BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)和分類細(xì)胞數(shù)。
　　3.4、病理標(biāo)本的制備及病理染色取每只小鼠左側(cè)肺組織，石蠟包埋后切片，行HE、AB-PAS、Masson染色，觀察各組小鼠肺組織炎癥浸潤，氣道上皮杯狀細(xì)胞化生及氣道壁周圍膠原沉積水平。
　　3.5、免疫組化染色采用SP法檢測肺組織中α-SMA和TGF-β1的表達(dá)定位。
　　3.6、 Western Blotting提取各組小鼠肺組織蛋白，檢測肺組織中α-S

14、MA、TGF-β1、p-Smad2/3和CollagenⅠ表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:1.慢性哮喘小鼠肺組織中組HDACs表達(dá)形態(tài)研究
　　1.1、Ⅰ類HDACs在肺組織中的表達(dá)形態(tài)Ⅰ類HDACs成員主要包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8，在哮喘致病過程中Ⅰ類HDACs成員的表達(dá)分布和表達(dá)水平均發(fā)生不同程度的改變。哮喘致病時肺組織氣道上皮細(xì)胞和肺泡腔炎癥細(xì)胞中均可見HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8

15、表達(dá)，除此之外在肺組織氣道及血管周圍炎癥細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中亦可見HDAC8高表達(dá)。進(jìn)一步分析Ⅰ類HDACs成員的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)哮喘致病時肺組織中HDAC1和HDAC8的表達(dá)量顯著升高，而HDAC2和HDAC3的表達(dá)量卻顯著降低。
　　1.2、Ⅱ類HDACs在肺組織中的表達(dá)形態(tài)哮喘致病過程中Ⅱ類HDACs成員（HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10）的表達(dá)定位和表達(dá)水平同樣發(fā)生不同程度的改變。其

16、中，HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HDAC9主要表達(dá)在肺組織氣道上皮細(xì)胞和肺泡腔炎癥細(xì)胞中，而HDAC10則僅見于氣道上皮細(xì)胞中。進(jìn)一步分析各HDACs成員的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)哮喘致病時肺組織中HDAC4表達(dá)水平降低，HDAC5和HDAC6表達(dá)增多，而HDAC7、HDAC9和HDAC10表達(dá)水平卻未見改變。
　　1.3、眾多HDACs家族成員中，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC5、HDAC6、HDAC8很可

17、能與哮喘致病密切相關(guān)。選擇性地升高HDAC2和HDAC3的表達(dá)，抑制HDAC1、HDAC5、HDAC6和HDAC8的表達(dá)很可能為哮喘療效帶來新的突破。
　　2.慢性哮喘小鼠肺組織中HDACs作用靶點探討
　　2.1、肺組織中乙?；揎椊M學(xué)數(shù)據(jù)定量分析哮喘小鼠肺組織中共鑒定到581個乙?；稽c，并對其中351個乙酰化位點進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)在所有的蛋白樣品中，乙?；稽c的調(diào)節(jié)修飾上下調(diào)比例幾乎一致(35∶33)，而組蛋白中的乙酰

18、化調(diào)節(jié)卻具有明顯趨勢(13∶2)，即在哮喘致病時絕大部分組蛋白的乙酰化位點修飾水平發(fā)生了上調(diào)。
　　2.2、差異性改變的組蛋白乙?；稽c分布組蛋白中差異性改變的乙?；稽c主要分布在H2B和H3上，而位于H1、H2A和H4上的眾多乙?；稽c卻并未發(fā)現(xiàn)乙酰化修飾水平的改變
　　2.3、肺組織中組蛋白差異修飾乙?；稽c氨基酸序列分析組蛋白中上調(diào)的乙?；稽c絕大部分均具有共同的氨基酸序列-KAXXK-，這一序列很可能是HDACs在選

19、擇調(diào)控組蛋白乙酰化位點時所偏好的氨基酸序列，很可能是哮喘致病過程中乙?；揎椀年P(guān)鍵靶點。
　　2.4、 HDACIs用于哮喘治療的總結(jié)與篩選-KAXXK-序列上的乙?；稽c很可能是HDACIs治療哮喘的關(guān)鍵靶點，但HDACIs對于哮喘的調(diào)控并不唯一，其可能是通過多個途徑共同完成的，而其他途徑的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。值得注意的是，HDAC6和HDAC8有望成為哮喘治療的新靶點。
　　3.特異性HDACIs對慢性哮喘小鼠的干

20、預(yù)作用
　　3.1、廣譜HDACIs(Givinostat)對慢性哮喘小鼠的干預(yù)作用Givinostat能有效緩解哮喘小鼠BALF中細(xì)胞因子釋放，肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，黏液分泌等炎癥性改變，顯著抑制哮喘肺組織中膠原沉積，減少α-SMA和TGFβ1表達(dá)，有效緩解哮喘氣道平滑肌增厚及上皮下纖維化等相關(guān)重塑性改變。
　　3.2、 HDAC6特異性抑制劑(Tubastatin A HCl)對慢性哮喘小鼠的干預(yù)作用TubastatinA

21、 HC1雖然能有效緩解哮喘氣道炎癥，但其抗炎效果略差于地塞米松、Givinostat和PCI-34051。但TubastatinA HC1抑制哮喘氣道高反應(yīng)和氣道重塑方面，尤其是抑制TGF-β1和α-SMA表達(dá)上卻并不遜色于其他藥物治療，反而略優(yōu)于PCI-34051。進(jìn)一步檢測與重塑反應(yīng)密切相關(guān)的TGF-β/Smad通路的激活水平，發(fā)現(xiàn)Tubastatin A HCl能夠顯著抑制Smad2/3的磷酸化修飾以及該通路下游蛋白Collage

22、nⅠ的表達(dá)水平。
　　3.3、 HDAC8特異性抑制劑(PCI-34051)對慢性哮喘小鼠的干預(yù)作用PCI-34051在緩解哮喘氣道炎癥方面具有明顯的優(yōu)勢，表現(xiàn)為PCI-34051干預(yù)哮喘小鼠后，顯著抑制BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，抑制BALF中炎癥因子IL-4、IL-5分泌，有效緩解肺組織氣道血管周圍炎癥浸潤、氣道上皮杯狀細(xì)胞化生及上皮下膠原沉積。
　　結(jié)論:1.在哮喘致病過程中不同HDACs成員的表達(dá)形態(tài)均發(fā)

23、生了不同程度改變，其中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC5、HDAC6、HDAC8很可能與哮喘致病密切相關(guān)，選擇性地升高HDAC2和HDAC3，抑制HDAC1、HDAC5、HDAC6和HDAC8的表達(dá)很可能為哮喘療效帶來新的突破。
　　2.H2B和H3上相關(guān)乙酰化位點的-KAXXK-序列很可能是HDACIs治療哮喘的關(guān)鍵作用靶點，但HDACIs治療哮喘的作用途徑并不唯一，很可能是通過多個通路實現(xiàn)的，其中特異性抑制HDAC