細胞色素c向過氧化物酶結(jié)構(gòu)—功能的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文細胞色素c向過氧化物酶結(jié)構(gòu)—功能的轉(zhuǎn)化研究姓名：王中華申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：無機化學(xué)指導(dǎo)教師：黃仲賢20070415行過專門的分子設(shè)計。因此通過分子設(shè)計和蛋白質(zhì)工程等方法，將C y t c 這個具有較高穩(wěn)定性的電子傳遞蛋白轉(zhuǎn)化為一個具有較高p e r o x i d a s e ．1 i k e 活性的酶分子，不但有助于我們對血紅素蛋白結(jié)構(gòu)一性質(zhì)一反應(yīng)一功能之間關(guān)系的理解，同時也有可能創(chuàng)造出一個具有一定應(yīng)用前景的、

2、新的金屬蛋白酶。通過對C y tf 的晶體結(jié)構(gòu)進行觀察分析后，我們發(fā)現(xiàn)P r 0 7 1 幾乎位于h e m e輔基M e t 8 0 一側(cè)的正上方，如果將P r 0 7 1 替換成H i s 7 1 后，H i s 7 1 上的N e 原子與h e i n e 中心F e 3 + 間的距離為一5 ．6 2A ，非常接近H R P 和C e P 分子中遠端組氨酸N ￡原子到h e m e 中心F e ”的距離( 在H R P 和C c

3、P 中該距離分別為一5 ．8 4 和一5 ．5 5A ) 。因而我們通過基因突變方法，首先用一個無配位能力的纈氨酸( V a l i n e 。V a l ) 取代了軸向配體M e t 8 0 ，得到一個C y t C 的單點突變體( C y t C M 8 0 V , M 8 0 V ) ；在此基礎(chǔ)上又用h i s t i d i n e 取代了7 l 位的p r o l i n e ，得到一個雙點突變體( C y tcP 7 1 H

4、 ／M 8 0 V , P 7 1 H ／M S O V ) 。突變體蛋白的p e r o x i d a s e ．1 i k e 催化活性實驗結(jié)果顯示，C y t f M 9 0 V 突變體蛋白的p e r o x i d a s e ．1 i k e 催化活性確實比野生型細胞色素c ( w i l dt y p ec y t o c h r o m e G W T C y t 力高；然而，再在7 l 位引入一個“d i s t a

5、 l h i s t i d i n e ”后所得C y t c P 7 1 H ／M 8 0 V 雙點突變體蛋白的催化活性不僅沒有比C y t c M S O V 高，反而比w T C y t c 還低。于是我們對P 7 1 H ／M S O V 蛋白性質(zhì)進行了一系列的研究，結(jié)果表明可能是由于C y t c 中Q l o o p D 肽段( r e s i d u e s 7 0 ．8 4 ) 具有很強的柔韌性，使得H i s 7 1

6、 并沒有象H R P 中的d i s t a lh i s t i d i n e 一樣起到酸堿催化功能，而是與h e m e 發(fā)生了配位作用，無論是在氧化態(tài)還是還原態(tài)都成了h e i n e 的第六軸向配體。由于在7 l 位引入的h i s t i d i n e 沒有起到d i s t a lh i s t i d i n e 的作用，我們對C y tc分子再次進行分析后發(fā)現(xiàn)，T y r 6 7 雖然不象P r 0 7 1 一樣位于

7、h e m e 的正上方( 假定h e i n e 位于水平面上，第五軸向配體H i s l 8 位于h e m e 的下方) ，但也位于h e m e 的斜上方。同時分子模擬結(jié)果顯示，如果將T y r 6 7 突變成H i s 6 7 后，H i s 6 7 的N ￡原子與h e m e 中心F e ”間的距離為一5 ．1 8 A ，接近H R P 中d i s t a l h i s t i d i n e 到h e i n e中心

8、F 礦的距離( - 5 ．8 4 A ) ，于是我們構(gòu)建了C y t C Y 6 7 H 和Y 6 7 H ／M 8 0 V 突變體基因并進行了蛋白表達和性質(zhì)研究。研究結(jié)果表明，C y t c Y 6 7 H 和Y 6 7 H ／M 8 0 V蛋白的過氧化物酶活性都在、ⅣTC y tc 的基礎(chǔ)上得到了很大的提高；而且在同樣條件下，C y tcY 6 7 H 催化氧化鄰甲氧基苯酚反應(yīng)得到的表觀二級反應(yīng)速率常數(shù)( k 砌，m ) 比天然過氧

9、化物酶H R P 還高。在天然過氧化物酶( 如H R P ) 中除了有一個遠端組氨酸外，還有一個遠端精氨酸( d i s t a la r g i n i n e ) 。為了模擬過氧化物酶的這一結(jié)構(gòu)，我們又制備了c y t cY 6 7 R 和Y 6 7 R ／P 7 1 H ／M 8 0 V 突變體蛋白，并對它們的基本性質(zhì)和催化活性進行了研究。結(jié)果表明在C y t c 的h e i n e 腔中引入的a r g i n i n e (