MiR-326通過(guò)FGF1調(diào)控Crybb2的表達(dá)延緩晶狀體渾濁的機(jī)制研究.pdf

1、白內(nèi)障嚴(yán)重影響人類健康，是最常見(jiàn)的致盲原因之一。其中絕大部分是隨年齡增長(zhǎng)所引起的老年性白內(nèi)障。目前國(guó)內(nèi)外治療老年性白內(nèi)障的方法仍集中于手術(shù)治療，缺乏有效的預(yù)防及早期治療藥物。因此，深入研究晶狀體渾濁的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，篩選有效的抗晶狀體渾濁藥物，尤其提倡從早期預(yù)防著手、盡力降低低齡患者的二次手術(shù)率，不僅能減輕患者痛苦，而且具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。
　　哺乳動(dòng)物晶狀體中的晶體蛋白，主要分為α、β、γ三大類。此前，文獻(xiàn)研究大都集中在α

2、族晶體蛋白類的研究，挖掘其“伴侶蛋白”對(duì)抗晶狀體渾濁的作用。但是，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，βB2晶體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能均十分特殊，且在哺乳動(dòng)物晶狀體中該蛋白成分含量最高，故其結(jié)構(gòu)及水溶性成分的水平對(duì)于維持晶狀體的透明性和折射率至關(guān)重要。如能適度調(diào)控其表達(dá)，有望成為延緩晶狀體渾濁進(jìn)程的有效手段。因此，βB2晶體蛋白更加適合作為年齡相關(guān)性晶狀體功能研究的靶蛋白。為此，探尋可調(diào)控βB2晶體蛋白表達(dá)的上游microRNA，并明確其調(diào)控機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控β

3、B2晶體蛋白在晶狀體中的表達(dá)量，進(jìn)而延緩晶狀體渾濁的進(jìn)程。
　　MicroRNAs是一類非編碼單鏈小分子RNA，在胚胎發(fā)育、分化，細(xì)胞增殖、凋亡、代謝和適應(yīng)環(huán)境壓力等進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起重要作用。研究表明miRNAs在眼部組織，包括角膜、脈絡(luò)膜小疣、視網(wǎng)膜、玻璃體、晶狀體和中均有特異性表達(dá)，并可能通過(guò)調(diào)控晶體蛋白的表達(dá)，參與晶狀體混濁的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。因此，探究特異性調(diào)控βB2晶體蛋白表達(dá)的miRNA，對(duì)老年性白內(nèi)障的早期預(yù)防和治療

4、具有重要價(jià)值。
　　本文探討miR-326在人晶狀體上皮細(xì)胞HLEC-B3中的功能及其調(diào)控Crybb2可能的分子機(jī)制，并驗(yàn)證了miR-326在硒性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體中的治療作用，為老年性白內(nèi)障的早期預(yù)防和治療提供了新途徑。
　　我們首先通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩查和文獻(xiàn)閱讀，篩選出miR-326、miR-204-5p、miR-491-5p、miR-330-5p四個(gè)與βB2基因相關(guān)的miRNA。之后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證了miR-3

5、26、miR-204-5p在βB2基因敲除(KO)小鼠晶狀體中的表達(dá)量與C57BL/6野生型(WT)小鼠相比明顯下調(diào)。其中，miR-326的表達(dá)差異最顯著，提示晶狀體中miR-326水平可能與Crybb2的表達(dá)有某種相關(guān)。隨后，我們?cè)谌司铙w上皮細(xì)胞HLEC-B3中，用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-326的下游靶基因?yàn)镕GF1。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí):在晶狀體上皮細(xì)胞中抑制miR-326的表達(dá)可促使FGF1的表達(dá)量增加，進(jìn)而上調(diào)Crybb2

6、的表達(dá)量，最終有助于抗晶狀體混濁的發(fā)生、發(fā)展。由此，初步闡明了在細(xì)胞中miR-326調(diào)控Crybb2的作用機(jī)制。此外，通過(guò)硒性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體中的研究也支持上述結(jié)論。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探尋出一條可以通過(guò)抑制晶狀體內(nèi)miR-326的表達(dá)，促使FGF1的表達(dá)、增加晶狀體內(nèi)βB2晶體蛋白表達(dá)量，從而有效延緩老年性白內(nèi)障的新途徑;并以此為基礎(chǔ)申報(bào)了國(guó)家發(fā)明專利;擬開發(fā)以miR-326為中心的新型抗晶狀體渾濁藥物，為老年性白內(nèi)障的“

7、未病先防”提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分 WT與Crybb2-/-小鼠晶狀體中miRNA的篩查
　　目的:篩查與βB2具有靶向聯(lián)系，且在WT與Crybb2-/-小鼠晶狀體中表達(dá)差異較大的miRNA。
　　方法:通過(guò)小鼠基因鑒定技術(shù)，鑒定WT、Crybb2-/-小鼠;通過(guò)PicTar、SangermiRBase及TargetScan algorithms數(shù)據(jù)庫(kù)及通路分析篩選出與βB2基因之間存在靶向性關(guān)系的miRNA

8、;采用qRT-PCR驗(yàn)證上述候選靶基因在WT、Crybb2-/-小鼠晶狀體中的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:(1)挑選出四個(gè)與βB2之間存在靶向性關(guān)系的miRNA: miRNA-326、miR-204-5p、 miR-330-5p、miR-491-5p;(2)通過(guò)qRT-PCR篩查發(fā)現(xiàn)miR-326、miR-204-5p在WT、Crybb2-/-小鼠晶狀體中表達(dá)差異顯著，尤其是miR-326的表達(dá)差異更為明顯。
　　結(jié)論: miR-

9、326可能通過(guò)某種途徑調(diào)控βB2晶體蛋白的表達(dá)。
　　第二部分 MiR-326在晶狀體上皮細(xì)胞(HLEC-B3)中調(diào)控Crybb2表達(dá)的機(jī)制探究
　　目的:探討miR-326通過(guò)何種通路影響下游基因、調(diào)控Crybb2表達(dá)。
　　方法:(1)采取雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，明確miR-326的下游靶基因;在HLEC-B3細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-326 agomir（模擬物）和antagomir（抑制體）72h后，采用wester

10、n blot、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)下游靶基因及Crybb2的表達(dá)情況;(2)在HLEC-B3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染FGF1因子及shFGF1，48h后采用western blot檢測(cè)Crybb2的表達(dá)變化;(3)在HLEC-B3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染FGF1因子及shFGF1，2h后兩組分別轉(zhuǎn)染miR-326antagomir，培養(yǎng)72h后采用western blot分別比較上述FGF1因子組及shFGF1組與陰性對(duì)照組中Crybb2表達(dá)的變化;(4)在H

11、LEC-B3細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-326 agomir和antagomir48h后，采用200μM H2O2處理HLEC-B3細(xì)胞24h，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-326的下游靶基因?yàn)镕GF1;(2) FGF1可以有效調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞中Crybb2的表達(dá);(3)證實(shí)在HLEC-B3中抑制miR-326表達(dá)后FGF1的表達(dá)量上調(diào)，最終使Crybb2高表達(dá);反之，在HLEC-B3中

12、增加miR-326的表達(dá)量后，F(xiàn)GF1的表達(dá)量下調(diào)，最終降低Crybb2的表達(dá);(4)在HLEC-B3中下調(diào)miR-326的表達(dá)量使FGF1表達(dá)上調(diào)，可以抑制晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:(1) miR-326通過(guò)與靶基因FGF1的3'-UTR結(jié)合而特異性抑制FGF1的表達(dá)，從而抑制Crybb2的表達(dá);(2)在晶狀體上皮細(xì)胞中抑制miR-326的表達(dá)可以抑制其凋亡，進(jìn)而與晶狀體渾濁的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。
　　第三部分 MiR

13、-326在硒性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體內(nèi)調(diào)控Crybb2表達(dá)并延緩白內(nèi)障進(jìn)展的探究
　　目的:探討miR-326在硒性白內(nèi)障模型鼠晶狀體內(nèi)調(diào)控Crybb2表達(dá)并延緩白內(nèi)障進(jìn)展的作用。
　　方法:9天齡SD大鼠皮下注射亞硒酸鈉溶液（25μmol/kg），構(gòu)建亞硒酸鈉白內(nèi)障模型鼠;左眼為陰性對(duì)照，滴加miR-326 antagomir（抑制體）的陰性對(duì)照，右眼為治療眼，滴加miR-326抑制劑antagomir（抑制體），陰性對(duì)照與

14、治療眼，每天早晚兩次滴藥，每次100μl，每天每只眼球共用藥1nmol，觀察白內(nèi)障渾濁進(jìn)展;采用qRT-PCR檢測(cè)晶狀體內(nèi)藥物作用情況，并采用western blot技術(shù)檢測(cè)晶狀體內(nèi)FGF1、Crybb2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)硒性白內(nèi)障模型鼠眼滴miR-326 antagomir（抑制體）后，其晶狀體內(nèi)miR-326表達(dá)量下降，F(xiàn)GF1及Crybb2表達(dá)量升高。(2)滴加miR-326 antagomir（抑制體）的治療眼