過表達(dá)hi-FGF2通過C1QBP介導(dǎo)細(xì)胞凋亡.pdf

1、成纖維細(xì)胞生長因子2(Fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF2)，也稱作堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)，是一種多功能的多肽細(xì)胞生長因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、粘附、遷移和凋亡。FGF2可產(chǎn)生多種分子量的FGF2亞型，包括18kDa的低分子量亞型(lo-FGF2)和22，23，24，34kDa等高分子量亞型(hi-FGF2)。hi-FGF2在線粒體參與情況

2、下，通過激活ERK1/2信號通路介導(dǎo)染色質(zhì)聚集和細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡從啟動、執(zhí)行、調(diào)控階段是由蛋白質(zhì)之間相互作用的結(jié)果。這種作用受蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、亞細(xì)胞定位及各種翻譯后修飾的影響。研究表明，能與hi-FGF2產(chǎn)生相互作用的蛋白主要有熱休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)，p68 RNA解旋酶（p68 RNA helicase，p68)和核不均一核糖核蛋白(Heterogeneous ribonucleopro

3、tein，hnRNPs)，而與hnRNP相互作用的蛋白又有 p68和補體成分1 Q亞補體結(jié)合蛋白（Complement component1Q subcomponent-binding protein，C1QBP)。并且有研究指出，與hnRNP相互作用的蛋白都是潛在的能與hi-FGF2相互作用的蛋白，應(yīng)作為進(jìn)一步的研究對象。而p68已證實和hi-FGF2相互作用，C1QBP引起了我們的關(guān)注。C1QBP，也稱作透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白1（Hyal

4、uronic acid binding protein1，HABP1)，在線粒體驅(qū)動的細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用。C1QBP能否與hi FGF2相互作用，以及是否在hi-FGF2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮關(guān)鍵作用未有研究報道。本研究通過在HEK293細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染hi-FGF2，建立hi-FGF2高表達(dá)模型，利用流式細(xì)胞檢測技術(shù)、RT-PCR、Western blot以及免疫共沉淀等方法，探討高表達(dá)hi-FGF2介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用和機制。

5、r>　　目的：
　　探討過表達(dá)hi-FGF2介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及其機制。
　　方法：
　　1. hi-FGF2-pDsRed1-N1重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化、擴增、提純等步驟，得到高純度質(zhì)粒DNA備用，并送至華大基因公司測序鑒定。
　　2.在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)hi-FGF2：采用瞬時轉(zhuǎn)染法，熒光倒置顯微鏡觀察hi-FGF2的轉(zhuǎn)染效率。
　　3.將培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞隨機分組：CON組、pDsRed組、hi-

6、FGF2組，檢測過表達(dá)hi-FGF2的HEK293細(xì)胞中細(xì)胞凋亡情況：JC-1染色，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測線粒體膜電位；Western-blot法檢測細(xì)胞色素C(Cyto C)在線粒體中和胞漿中的蛋白水平。
　　4. Western-blot法檢測HEK293細(xì)胞中hi-FGF2過表達(dá)后的C1QBP的蛋白水平。
　　5. RT-PCR法檢測HEK293細(xì)胞中hi-FGF2過表達(dá)后的C1QBP的mRNA表達(dá)水平。
　　

7、6.將培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞隨機分組：分為正常對照組(INPUT)三組，分別為：CON組、pDsRed組、hi-FGF2組；陰性對照組(IgG)三組，分別為：CON組、pDsRed組、hi-FGF2組；免疫沉淀（IP）組三組，分別為：CON組、pDsRed組、hi-FGF2組，免疫共沉淀法檢測過表達(dá)的hi-FGF2與C1QBP的相互作用。
　　7.在HEK29細(xì)胞中，采用瞬時轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染C1QBP RNAi，熒光倒置顯微鏡觀察si-

8、C1QBP的轉(zhuǎn)染效率，PCR和Western-blot法檢測C1QBP RNAi干擾效率。
　　8.純化線粒體蛋白，檢測過表達(dá)的hi-FGF2在線粒體中的表達(dá)及干擾C1QBP后hi-FGF2在線粒體中的變化。
　　9.將培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞隨機分組：CON組、pDsRed組、NC組、si-C1QBP組、hi-FGF2、si-C1QBP+hi-FGF2共轉(zhuǎn)染組，檢測干擾C1QBP后，過表達(dá)hi-FGF2的細(xì)胞凋亡情況的變化：

9、 JC-1染色，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測線粒體膜電位；Western-blot法檢測Cyto C在線粒體中和胞漿中的蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1.質(zhì)粒hi-FGF2-pDsRed1-N1經(jīng)華大基因測序，采用NCBI BLAST軟件進(jìn)行比對，測序結(jié)果與目的基因序列完全一致，插入方向和讀碼框架正確，重組質(zhì)粒正確。
　　2.成功轉(zhuǎn)染hi-FGF2-pDsRed1-N1到HEK293細(xì)胞中，在熒光倒置顯微鏡下可觀測到紅色熒光

10、，并提示過表達(dá)hi-FGF2主要定位在細(xì)胞核，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80％以上。線粒體膜電位檢測結(jié)果表明，hi-FGF2組凋亡率為(54.10±3.94)%，與CON組(3.95±0.64)%和pDsRed組(9.41±0.31)%相比，凋亡率顯著性升高(P<0.01)；Western blot檢測Cyto C表達(dá)結(jié)果顯示，在線粒體中，hi-FGF2組(0.61±0.06) Cyto C表達(dá)比CON組、pDsRed組(1.23±0.12)顯著減少

11、(P<0.05)，并且有Cyto C釋放到胞漿。
　　3.過表達(dá)hi-FGF2的HEK293細(xì)胞中，hi-FGF2組(2.23±0.05)，與CON組、pDsRed組(1.13±0.01)相比，C1QBP蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；hi-FGF2組(2.16±0.03)與CON組、pDsRed組(0.85±0.01)，hi-FGF2組C1QBP mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)。
　　4. Western blot

12、結(jié)果顯示，用FGF2抗體可以將C1QBP從細(xì)胞裂解液中沉淀下來，同時用C1QBP抗體可以將hi-FGF2蛋白從細(xì)胞裂解液中沉淀下來，而用抗鼠/兔IgG抗體免疫沉淀的陰性對照組中未檢測到RFP和C1QBP，說明過表達(dá)hi-FGF2與C1QBP在細(xì)胞內(nèi)存在特異性的相互作用。
　　5.倒置熒光顯微鏡下觀察C1QBP轉(zhuǎn)染效率，NC陰性對照有Cy3紅色熒光標(biāo)簽，可以觀察到轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%；RT-PCR檢測C1QBP干擾效率，以CON mR

13、NA表達(dá)量為1，NC、C1QBP1/1:2、 C1QBP1/1:4、C1QBP1/1:6、C1QBP2/1:2、C1QBP2/1:4、C1QBP2/1:6、C1QBP3/1:2、C1QBP3/1:4、C1QBP3/1:6分別為(1.05±0.01)、(0.61±0.01)、(0.43±0.00)、(0.29±0.00)、(0.55±0.01)、(0.35±0.01)、(0.20±0.00)、(0.63±0.01)、(0.63±0.01)

14、、(0.69±0.01)，si-RNA中以si-RNAⅡ，在lip2000:siRNA=1:6時干擾效率最高，達(dá)到80%。Western-blot檢測進(jìn)一步驗證干擾效率，以CON光密度為1，NC、si-C1QBP的光密度分別為(1.17±0.02)、(0.18±0.01)。
　　6.以RFP為檢測抗體，線粒體中，si-C1QBP+hi-FGF2組(0.33±0.02)比hi-FGF2組表達(dá)顯著的降低(P<0.01)，干擾C1QBP

15、能明顯抑制hi-FGF2在線粒體中的表達(dá)。
　　7.線粒體膜電位檢測結(jié)果表明，各組凋亡率分別為CON組(3.95±0.64)%、pDsRed組(9.41±0.31)%、NC組(5.38±0.38)%、hi-FGF2組(54.10±3.94)%、si-C1QBP組(11.21±0.21)%，si-C1QBP+hi-FGF2組(19.30±1.78)%凋亡率與hi-FGF2組(54.10±3.94)%比較，顯著降低(P<0.01)；而

16、 Western blot檢測 Cyto C表達(dá)結(jié)果顯示，表達(dá)si-C1QBP+hi-FGF2組(0.73±0.14)和hi-FGF2組(0.61±0.06)與CON組相比，顯著減少(P<0.05)，胞漿中Cyto C的表達(dá)si-C1QBP(0.74±0.17)與hi-FGF2相比，顯著減少(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　hi-FGF2在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其作用機制可能hi-FGF2上調(diào)C1QBP的