過表達(dá)miR-506通過靶向星形細(xì)胞上調(diào)基因(AEG-1)抑制骨肉瘤的增殖并促進(jìn)其凋亡.pdf

1、背景和目的：
　　骨肉瘤是兒童和青少年中一種非常普遍的原發(fā)惡性骨瘤，其特點(diǎn)為具有破壞周圍組織并幾乎專一地向肺轉(zhuǎn)移的高度惡化的傾向，這些是其引起死亡的主要原因。在年輕的病人中，它主要定位于股骨遠(yuǎn)端和股骨近端區(qū)域。盡管骨肉瘤已經(jīng)面對(duì)新輔助化學(xué)療法和手術(shù)的聯(lián)合治療超過30年，再發(fā)或者轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者仍然存在極差的預(yù)后，伴隨著不到10％的長(zhǎng)期生存。到目前為止，骨肉瘤的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)移的潛在的分子機(jī)制仍不完全為人們所知。因此，鑒定針對(duì)骨肉瘤

2、的新的治療靶位和發(fā)展治療策略仍是非常必要的。
　　miRNAs作為一組小非編碼單鏈的RNA片段，其長(zhǎng)度大小為18-25個(gè)核苷酸，這類非編碼RNA在腫瘤形成和癌癥進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。近期的研究表明，這些miRNAs可以通過與其靶基因的mRNA的3’-UTR或者編碼區(qū)不完全的堿基互補(bǔ)配對(duì)來抑制其翻譯成蛋白質(zhì)或者直接降解其mRNA片段。這些數(shù)據(jù)表明，miRNAs可以用來作為診斷生物標(biāo)志物并發(fā)揮其致癌基因或者抑癌基因的功能作用，其致

3、癌性或抑癌性是基于其靶向的mRNAs的功能決定的。據(jù)報(bào)道，許多miRNAs，例如miR-29，miR-125b，miR-143，miR-199a-3p等等，可以參與骨肉瘤（OS）的腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等過程。先前的研究表明，惡性轉(zhuǎn)移的支氣管上皮細(xì)胞中miR-506的恢復(fù)可以抑制細(xì)胞的增殖作用。miR-506的過表達(dá)可以抑制上皮-間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)變并抑制人乳腺癌細(xì)胞的粘附，入侵和遷移。而且，miR-506在建立的羥基喜樹堿耐受的結(jié)腸癌細(xì)胞中的

4、過表達(dá)可以通過抑制過氧化物酶體活化的受體α(PPARα)的表達(dá)發(fā)揮對(duì)羥基喜樹堿的耐受作用。雖然近年來miR-506已經(jīng)得到了廣泛的研究，然而它在骨肉瘤（OS）發(fā)起和進(jìn)展中的作用以及其發(fā)揮功能作用的分子機(jī)制仍知之甚少。
　　本課題包括以下三部分：第一部分：AEG-1和miR-506在骨肉瘤（OS）中的功能研究；第二部分：miR-506通過靶向抑制AEG-1發(fā)揮對(duì)骨肉瘤（OS）的功能作用；第三部分：miR-506、AEG-1通過調(diào)節(jié)W

5、nt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮其對(duì)骨肉瘤（OS）的抑制作用。
　　第一部分 AEG-1和miR-506在骨肉瘤（OS）中的功能研究
　　方法：
　　1.通過western blot和real-time PCR的方法分別檢測(cè)了AEG-1和miR-506在骨肉瘤（OS）組織和細(xì)胞系MG63中的表達(dá)水平。
　　2.通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AEG-1的敲低或miR-506過表達(dá)對(duì)骨肉瘤（OS）細(xì)胞系MG63細(xì)胞活性的影響

6、。
　　3.通過流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè) AEG-1的敲低或 miR-506過表達(dá)對(duì)骨肉瘤（OS）細(xì)胞系MG63的細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.通過構(gòu)建骨肉瘤（OS）的小鼠模型，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證miR-506對(duì)骨肉瘤（OS）的功能作用。
　　結(jié)果：
　　1.骨肉瘤（OS）中miR-506的表達(dá)水平與AEG-1的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　2. AEG-1的敲低或miR-506的表達(dá)上調(diào)可以抑制骨肉瘤（OS）細(xì)胞系

7、MG63的增殖。
　　3. AEG-1的敲低或miR-506的表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)骨肉瘤（OS）細(xì)胞系MG63的凋亡活性。
　　4. miR-506的過表達(dá)可以抑制體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中骨肉瘤（OS）的細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　第二部分 miR-506通過靶向抑制AEG-1發(fā)揮對(duì)骨肉瘤（OS）的功能作用
　　方法：
　　1.通過生物信息學(xué)分析推測(cè)miR-506的靶基因。
　　2.構(gòu)建野生和突變型的AEG-13’-UTR的重組質(zhì)

8、粒，通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 miR-506的靶基因。
　　3.通過western blot和real-time PCR的方法檢測(cè)miR-506過表達(dá)和敲低后AEG-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示AEG-1為miR-506的靶位基因。
　　2.雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證AEG-1為miR-506的靶位基因。
　　3. miR-506的過表達(dá)可以抑制骨肉瘤（OS）細(xì)胞系MG63中AEG-1的

9、表達(dá)。
　　第三部分 miR-506、AEG-1通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮其對(duì)骨肉瘤（OS）的抑制作用
　　方法：
　　1.通過western blot和real-time PCR的方法檢測(cè)miR-506過表達(dá)或AEG-1的敲低對(duì)β-catenin，c-myc和cyclin D1的表達(dá)水平的影響。
　　2.通過流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)si-β-catenin造成的Wnt/β-catenin信號(hào)通路

10、的抑制對(duì)骨肉瘤（OS）細(xì)胞系MG63細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.通過流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè) Wnt/β-catenin信號(hào)通路的小分子抑制CGP049090對(duì)骨肉瘤（OS）細(xì)胞系MG63功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1. miR-506的表達(dá)上調(diào)和AEG-1的表達(dá)下調(diào)可以明顯降低骨肉瘤（OS）細(xì)胞系MG63中β-catenin，c-myc和cyclin D1的表達(dá)水平。
　　2. si-β-catenin造成的Wnt

11、/β-catenin信號(hào)通路的阻斷可以抑制骨肉瘤（OS）細(xì)胞系MG63的細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。
　　3. Wnt/β-catenin信號(hào)通路的小分子抑制CGP049090可以抑制骨肉瘤（OS）細(xì)胞系MG63的細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.骨肉瘤（OS）中miR-506的表達(dá)水平與AEG-1的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　2. miR-506的表達(dá)上調(diào)可以抑制骨肉瘤（OS）細(xì)胞系的增殖。