星形膠質細胞通過Cx47上調少突膠質前體細胞S1PR3的表達并促進其增殖.pdf

1、神經退行性疾病是一類慢性、進行性神經系統(tǒng)疾病的總稱。其發(fā)病率高、病期長、并且缺乏特異性治療方法與措施。該類疾病給個人、家庭、社會帶來了沉重的經濟負擔與社會負擔的雖然這類疾病的病變部位及原因各不相同,但髓鞘產生不同程度破壞或發(fā)生脫髓鞘病變是它們的共同點。主要表現為伴隨著少突膠質細胞（oligodendrocyte，OL）的減少以及脫髓鞘。雖然對于這類疾病有很多的研究，少突膠質細胞的損傷和再生修復的的具體機制依然不清楚。
　　少突膠質

2、細胞作為中樞神經系統(tǒng)唯一的髓鞘形成細胞。其前體細胞-少突膠質前體細胞（oligodendrocyte progenitor cell，OPC）具有良好的增殖能力，能在體內增殖、遷移，最后形成成熟的少突膠質細胞，為髓鞘形成發(fā)揮極其重要的作用。無論內源性誘導還是外源性移植，如何獲取大量的OPC，或者促進OPC再生成為治療脫髓鞘疾病的關鍵。我們前期發(fā)現星形膠質細胞（astrocytes，AST）與OPC在接觸共培養(yǎng)的條件下促進其增殖，但具體調

3、控增殖的機制尚不清楚。本實驗探討了ASTs影響OPCs增殖的具體機制。為治療脫髓鞘疾病提供了新的實驗依據與理論基礎。
　　本研究分為以下三個部分：
　　第一部分：星形膠質細胞通過Cx47促進OPCs增殖
　　本部分通過使用星形膠質細胞與OPC不同的培養(yǎng)方式，利用細胞流式、EdU檢測細胞周期及增殖。采用二代測序分析了不同培養(yǎng)條件下所有的差異基因，篩選有效的差異基因Cx47。構建有效的Cx47 siRNA，WB、PCR檢測

4、Cx47蛋白基因變化，細胞流式檢測細胞周期、EdU檢測細胞增殖情況。
　　主要結果如下：
　　1.OPCs與ASTs直接接觸共培養(yǎng)后，光鏡、流式、EdU檢測顯示ASTs促進OPCs增殖較單獨培養(yǎng)組與上清培養(yǎng)組更明顯，處于細胞周期S期細胞比例明顯增加（P＜0.05），新生細胞數目占總細胞數比例顯著增加（P＜0.001）。
　　2.OPCs與ASTs直接接觸共培養(yǎng)中，Cx47促進了OPCs增殖。
　　3.干擾Cx47

5、后，Cx47蛋白與基因表達明顯下降（P＜0.001），細胞周期阻滯（P＜0.01），增殖能力降低（P＜0.001）。
　　上述結果說明ASTs促進OPCs的增殖可能通過直接接觸的Cx47。
　　第二部分：星形膠質細胞通過Cx47促進少突膠質前體細胞S1PR3表達誘導其增殖
　　在證實接觸共培養(yǎng)更能促進OPCs增殖的前提下，我們進一步比較了共培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)條件下下游膜信號的變化，利用接觸式共培養(yǎng)組差異表達基因GO細胞組分

6、分析，顯示主要位于細胞外基質、胞外區(qū)、細胞膜。以G-protein coupled receptor activity聚類分析顯示，在S1PRs家族中表達三個亞型，S1PR1、S1PR3、S1PR5，尤以S1PR3在接觸共培養(yǎng)組較單獨OPCs培養(yǎng)組差異性最為顯著。本部分在ASTs與OPCs接觸共培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)的條件下，進一步檢測了Cx47影響少突膠質前體細胞增殖的機制，流式、共聚焦檢測Cx47干擾后Ca2+的表達，WB、PCR檢測下游的

7、S1PR3表達，流式檢測細胞周期。EdU檢測細胞增殖情況。利用S1PR3的拮抗劑后，WB檢測了S1PR3，EdU檢測細胞增殖情況。
　　主要結果如下：
　　1.Cx47干擾后，流式檢測Ca2+濃度下降（P＜0.05），與共聚焦結果一致（P＜0.001）。
　　2.下游受體信號的變化以 S1PRs家族在共培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)差異最為顯著，尤以S1PR3最為明顯。
　　3.干擾Cx47后S1PR3的蛋白表達下降（P＜0.0

8、01）、基因表達下降（P＜0.01）。
　　4.拮抗S1PR3后，相比單獨培養(yǎng)組，在共培養(yǎng)組 OPCs細胞周期G1期阻滯（P＜0.05），EdU檢測新生細胞數占總細胞數比例下降（P＜0.001）。
　　以上結果表明OPCs與ASTs接觸共培養(yǎng)中，Cx47觸發(fā)Ca2+內流，上調S1PR3的表達調控OPCs的增殖。
　　第三部分：ASTs通過上調少突膠質前體細胞S1PR3激活ERK/p21通路誘導其增殖
　　本部分在

9、ASTs與OPCs接觸共培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)的條件下，主要探討了Cx47調控S1PR3表達促進少突膠質前體細胞增殖的下游通路。S1PR3拮抗后，WB檢測了ERK1/2、p-ERK1/2、p21的蛋白變化。PCR檢測了Id4的變化。EdU檢測細胞增殖。
　　主要結果如下：
　　1.S1PR3拮抗后，p-ERK1/2降低（P＜0.001），p21表達增高（P＜0.05），細胞增殖能力下降（P＜0.001）。
　　2.ERK1/2