AGTR1對肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響及其靶向治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，加深了人們對腫瘤異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)，含有大量腫瘤臨床樣本多組學(xué)數(shù)據(jù)庫的TCGA及Oncomine分析平臺(tái)為腫瘤個(gè)體差異的基因分型、治療與生存期的整合研究提供了大樣本數(shù)據(jù)庫，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并越來越多地運(yùn)用到腫瘤的個(gè)體化精準(zhǔn)治療的研究中來。
　　肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已成為中國第二世界第三位的癌癥死亡原因。中國為肝癌高發(fā)病率國

2、家，手術(shù)切除被認(rèn)為是可能治愈初診HCC患者的療法，但只有約10％～20％的患者腫瘤可切除，且手術(shù)病人面臨腫瘤復(fù)發(fā)的可能，最近的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)2000年至2014年間中國肝癌患者5年生存率僅為14.1％。
　　近年來針對肝癌靶向治療藥物的研發(fā)逐漸成為熱點(diǎn)，但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突變參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，而其精確的分子機(jī)制尚不完全清楚，導(dǎo)致靶向制劑對腫瘤患者個(gè)體的治療效果差異大，藥物靶向性較低。目前，作為首個(gè)美國FDA批準(zhǔn)上

3、市，用于晚期HCC靶向治療的多激酶抑制劑索拉菲尼，其有效率也僅為25％。
　　1995年Lever在The Lancet雜志發(fā)表一項(xiàng)大型開創(chuàng)性回顧研究，發(fā)現(xiàn)服用血管緊張素酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEIs)和血管緊張素受體抑制劑(angotensin recepter blockers，ARBs)的病人比未服用該類藥物的病人患乳腺癌和肺癌的風(fēng)險(xiǎn)更低。隨后另一部分的

4、學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究卻未得到類似結(jié)果。這個(gè)不同的研究結(jié)果引起眾多學(xué)者的關(guān)注，在這些研究中除了入選患者種族、人群及服藥周期等不同因素外，由于受到基因測序技術(shù)的限制，大部分的患者未做個(gè)體基因表達(dá)譜測定，導(dǎo)致患者個(gè)體基因差異未做考慮。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，在腎素血管緊張素系統(tǒng)中一個(gè)關(guān)鍵受體AT1R(type-1angiotensinⅡ)其編碼的基因AGTR1在多個(gè)腫瘤中發(fā)生異質(zhì)性表達(dá)，并且高表達(dá)該基因會(huì)引起多種腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌

5、等的不良預(yù)后，但是AGTR1基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及對肝癌的影響卻少有報(bào)道。對TCGA數(shù)據(jù)庫中全部3個(gè)肝細(xì)胞癌的臨床374例RNA芯片數(shù)據(jù)的AGTR1基因表達(dá)與臨床生存期的相關(guān)性進(jìn)行分析，提示AGTR1在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了AGTR1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對肝癌影響的研究。
　　第一部分 AGTR1差異表達(dá)對肝細(xì)胞癌發(fā)展的影響
　　選用Oncomine數(shù)據(jù)庫中全部3個(gè)肝細(xì)胞癌的臨床347例RN

6、A芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)AGTR1基因在這3個(gè)數(shù)據(jù)集中均位于過表達(dá)基因前5％，并在部分肝細(xì)胞癌患者中出現(xiàn)高表達(dá)。同時(shí)在TCGA數(shù)據(jù)庫中對全部374例的肝細(xì)胞癌臨床樣本進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)AGTR1表達(dá)前80位和后80位的樣本AGTR1的相對表達(dá)具有顯著差異，進(jìn)一步結(jié)合數(shù)據(jù)庫中肝細(xì)胞癌樣本預(yù)后數(shù)據(jù)，采用Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)組患者的生存期較高表達(dá)組顯著延長。以上結(jié)果說明，AGTR1在部分肝細(xì)胞癌患者中呈高表達(dá)，且這種高表達(dá)與患

7、者的生存期相關(guān)，由此初步推斷AGTR1在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。為了證明AGTR1基因在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用，篩選低表達(dá)AGTR1的SMMC-7721和BEL-7404細(xì)胞，對它們進(jìn)行過表達(dá)AGTR1的改造，同時(shí)選擇高表達(dá)AGTR1的MHCC-97H細(xì)胞進(jìn)行干擾表達(dá)的改造，體內(nèi)外研究AGTR1對肝細(xì)胞癌的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGTR1在體外實(shí)驗(yàn)中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞侵襲及遷移的作用，而在體內(nèi)試驗(yàn)中能加

8、速裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)的腫瘤形成及生長。此外，采用含有l(wèi)uciferine片段的載體構(gòu)建sh-AGTR1和sh-nc，穩(wěn)篩低表達(dá)AGTR1的MHCC-97H細(xì)胞，采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，在體觀察不同AGTR1表達(dá)量的MHCC-97H細(xì)胞在脾臟肝轉(zhuǎn)移模型中的轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)抑制AGTR1可以降低MHCC-97H腫瘤細(xì)胞的脾臟肝轉(zhuǎn)移能力。
　　第二部分 AGTR1差異表達(dá)影響肝細(xì)胞癌生長的作用機(jī)制研究
　　為了探討AGTR1促進(jìn)HCC

9、細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移作用機(jī)制，采用Westen Blot方法檢測過表達(dá)和干擾表達(dá)AGTR1對HCC細(xì)胞信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HCC細(xì)胞中的AGTR1可以促進(jìn)JAK2、STAT3、ERK的磷酸化，抑制AGTR1則可以降低相應(yīng)分子的磷酸化。且JAK2特異性抑制劑AG490可以抑制AGTR1介導(dǎo)的HCC細(xì)胞的生長、克隆形成、遷移及侵襲能力。此外，先用TCGA數(shù)據(jù)庫中374例肝細(xì)胞癌患者的mRNA芯片數(shù)據(jù)，對VEGF與AGTR1進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)

10、現(xiàn)隨著AGTR1的表達(dá)量的上升，VEGF與AGTR1表達(dá)相關(guān)性也隨之上升。對低表達(dá)AGTR1的SMMC-7721，BEL-7404細(xì)胞過表達(dá)AGTR1，兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)也隨著AGTR1的表達(dá)上升而上升。對高表達(dá)AGTR1的MHCC-97H細(xì)胞干擾表達(dá)AGTR1，VEGF的表達(dá)也隨之下降，且因AGTR1的高表達(dá)或過表達(dá)引起的VEGFA的上調(diào)表達(dá)可以被AG490抑制。由此可以推斷，AGTR1的高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)JKA2的磷酸化，

11、進(jìn)而激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)STAT3、ERK等分子的磷酸化，這些磷酸化的分子可進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)VEGF等分子的轉(zhuǎn)錄、翻譯、合成，促進(jìn)細(xì)胞分泌VEGF等細(xì)胞因子，大量新分泌的VEGF與細(xì)胞表面的受體結(jié)合可能會(huì)進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)STAT3、MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管的生成及細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)過程。
　　第三部分 AGTR1抑制劑對HCC細(xì)胞體內(nèi)外抗腫瘤作用效果研究
　　本部分研究中選擇臨床應(yīng)用時(shí)間最長、應(yīng)用病例最多的洛沙坦

12、作為靶向AGTR1的抑制劑考察其作用效果。在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)洛沙坦?jié)舛葹?～100μM時(shí)，能夠不同程度的抑制AGTR1高表達(dá)的MHCC-97H細(xì)胞和AGTR1過表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞的體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力，但對AGTR1低表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞和AGTR1干擾表達(dá)的MHCC-97H細(xì)胞則無上述作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，選用高表達(dá)AGTR1的MHCC-97H細(xì)胞，在裸鼠皮下成瘤模型中，經(jīng)過4周給藥，相比空白對照組，20

13、mg·Kg-1～80mg·Kg-1給藥劑量的洛沙坦能不同程度的抑制裸鼠皮下腫瘤的生長。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)隨著給藥劑量的增加，瘤內(nèi)AT1R、VEGFA及CD31蛋白的表達(dá)水平顯著下降，血清VEGFA量也隨著洛沙坦的給藥劑量提高而受到不同程度的抑制。由此考察了洛沙坦在體內(nèi)外水平對AGTR1高表達(dá)HCC細(xì)胞生長及腫瘤血管形成的抑制作用。
　　綜上所述，本課題通過TCGA數(shù)據(jù)庫中全部肝細(xì)胞癌的臨床374例RNA芯片數(shù)據(jù)，對AGTR1基因表達(dá)

14、與臨床生存期的相關(guān)性進(jìn)行分析，提示AGTR1在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了AGTR1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對肝癌影響的研究。對6種不同的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(HepG2、BEL-7402、BEL-7404、SMMC-7721、MHCC97H、HLF)與正常肝細(xì)胞系(QSG-7701)進(jìn)行AGTR1的mRNA及蛋白的表達(dá)檢測，證實(shí)相比正常肝細(xì)胞系(QSG-7701)，肝細(xì)胞癌細(xì)胞系MHCC97H、HLF中AGTR1m

15、RNA和蛋白水平均有顯著的上調(diào)表達(dá)，而在BEL-7404、SMMC-7721中AGTR1mRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著低于正常肝細(xì)胞的表達(dá)水平。通過驗(yàn)證臨床肝癌樣本中AGTR1的表達(dá)情況，顯示33例肝細(xì)胞癌樣本中有20例臨床樣本AGTR1呈上調(diào)表達(dá)或高表達(dá)。進(jìn)一步通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AGTR1后可促進(jìn)HCC細(xì)胞體外增殖、克隆形成、細(xì)胞侵襲及遷移能力，加速裸鼠皮下腫瘤形成及生長;而抑制AGTR1的表達(dá)可降低HCC細(xì)胞體外增殖、克隆形成

16、、細(xì)胞侵襲及遷移能力，并降低HCC腫瘤細(xì)胞的脾臟肝轉(zhuǎn)移能力。通過對AGTR1相關(guān)通路的分析，揭示AGTR1高/過表達(dá)HCC細(xì)胞主要通過JAK2/STAT3通路介導(dǎo)其生長、增殖、遷移及侵襲過程，同時(shí)驗(yàn)證了AGTR1靶向抑制劑的作用。在藥效實(shí)驗(yàn)中，探討以AGTR1靶向抑制劑洛沙坦對HCC細(xì)胞的作用效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外試驗(yàn)中，當(dāng)洛沙坦?jié)舛葹?～100μM時(shí)，能夠不同程度的抑制AGTR1高/過表達(dá)HCC細(xì)胞的體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力。

17、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的裸鼠皮下成瘤模型中，經(jīng)過4周給藥(20mg·Kg-1～80mg·Kg-1)，洛沙坦能顯著抑制AGTR1高表達(dá)HCC細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤的生長，降低腫瘤組織中AGTR1、VEGFA及CD31蛋白表達(dá)。由此證明了洛沙坦在體內(nèi)外水平具有抑制AGTR1高表達(dá)HCC細(xì)胞生長的作用。研究結(jié)果明確了AGTR1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，探討了AGTR1促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞異常生長的可能機(jī)制，為AGTR1高表達(dá)肝細(xì)胞癌靶向治療藥物的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)