衣殼蛋白突變型腺相關(guān)病毒2型載體的構(gòu)建及應(yīng)用的初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建衣殼突變型血清2型腺相關(guān)病毒載體，增強(qiáng)其通過(guò)玻璃體腔注射途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)衣殼蛋白突變型AAV2載體的轉(zhuǎn)染效率。
　　方法：將AAV2載體衣殼蛋白表面的氨基酸殘基用基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?duì)其特異位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建衣殼蛋白突變型AAV2(quardY-F+T-V)-ZsGreen1載體。體外實(shí)驗(yàn)：分別將0.1 ml AAV2-ZsGreen1，AAV8-Cherry和AAV2(quardY-F+T-V)-

2、ZsGreen1感染RGC-5細(xì)胞，48小時(shí)后通過(guò)細(xì)胞流式儀（FACS）檢測(cè)感染細(xì)胞陽(yáng)性率。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將野生型的C57 BL/6小鼠分成三組，通過(guò)玻璃體腔注射途徑分別將1ulAAV2-ZsGreen1，1ul AAV8-Cherry和1ulAAV2(quardY-F+T-V)-ZsGreen1注入小鼠右眼中，4周后行視網(wǎng)膜切片，用熒光顯微鏡照相，并對(duì)熒光蛋白表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：三種載體感染 RGC-5細(xì)胞的陽(yáng)性率分別為2.31％

3、，5.52%，4.77%，未感染細(xì)胞的陽(yáng)性率檢測(cè)為1.80%；構(gòu)建的AAV2(quardY-F+T-V)-ZsGreen1載體通過(guò)玻璃體腔注射途徑，能表達(dá)至視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)從狀層，內(nèi)核層，外從狀層和外核層，而AAV2- ZsGreen1和AAV8-Cherry通過(guò)玻璃體腔注射途徑，在視網(wǎng)膜表達(dá)極少，僅在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層見(jiàn)到熒光蛋白表達(dá)，構(gòu)建的載體與常規(guī)載體相比熒光蛋白表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，常規(guī)載體的熒光表達(dá)量之間不存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

4、。
　　結(jié)果：三種載體感染 RGC-5細(xì)胞的陽(yáng)性率分別為2.31%，5.52%，4.77%，未感染細(xì)胞的陽(yáng)性率檢測(cè)為1.80%；構(gòu)建的AAV2(quardY-F+T-V)-ZsGreen1載體通過(guò)玻璃體腔注射途徑，能表達(dá)至視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)從狀層，內(nèi)核層，外從狀層和外核層，而AAV2- ZsGreen1和AAV8-Cherry通過(guò)玻璃體腔注射途徑，在視網(wǎng)膜表達(dá)極少，僅在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層見(jiàn)到熒光蛋白表達(dá)，構(gòu)建的載體與常規(guī)載體相比熒