人低氧誘導(dǎo)因子1α及其突變型重組腺病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、缺血性心臟病目前治療主要是常規(guī)的藥物治療、冠脈介入(PCI)及冠脈旁路移植術(shù)(CABG)，然而相當(dāng)一部分患者藥物治療難以見(jiàn)效，也不適于常規(guī)血運(yùn)再通術(shù)處理，所以必須尋求其它方法。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，基因治療促缺血心肌血管新生已成為冠脈血運(yùn)重建術(shù)中具有發(fā)展前景的新方向。促血管生長(zhǎng)因子研究較多的有VEGF、FGF等，雖然Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果證明安全有效，但Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想，資料顯示VEGF可導(dǎo)致血管滲漏、組織水腫等，F(xiàn)GF治

2、療則與蛋白尿有關(guān)。血管生長(zhǎng)過(guò)程本身受一系列生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)，單個(gè)生長(zhǎng)因子治療并不足以誘導(dǎo)成熟的血管新生。低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxiainduciblefactor1,HIF-1)是細(xì)胞對(duì)低氧/缺氧作出適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)對(duì)VEGF等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與了血管新生、紅細(xì)胞生成等病理生理過(guò)程。HIF-1α是其亞單位，決定HIF-1的活性。然而HIF-1α常氧下容易降解，主要與常氧狀態(tài)下HIF-1αODD區(qū)Pro564和Pr

3、o402發(fā)生羥基化有關(guān)，突變其中任一位點(diǎn)的單突變型HIF-1α在常氧下都可以得到表達(dá)。臨床前期研究表明，應(yīng)用具有組成型表達(dá)活性的HIF-1α基因治療可誘導(dǎo)生理功能完整的血管新生。基因轉(zhuǎn)移載體中質(zhì)粒載體由于其轉(zhuǎn)染效率低很難在靶細(xì)胞得到目的基因高表達(dá)，腺病毒載體較其他病毒載體具有制備容易、感染譜廣、病毒滴度高、不引起插入突變等優(yōu)點(diǎn)而成為治療性血管新生最具臨床應(yīng)用價(jià)值的載體之一。因此，我們?cè)跇I(yè)已完成對(duì)HIF-1αPro564定點(diǎn)突變及表達(dá)分析

4、基礎(chǔ)上，擬構(gòu)建能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到外源基因高表達(dá)的攜帶HIF-1α及HIF-1αAla564基因的重組腺病毒載體Adeno-HIF-1α及Adeno-HIF-1αAla564，為進(jìn)一步研究HIF-1α基因及其突變型對(duì)缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 目的構(gòu)建能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到外源基因高表達(dá)的攜帶HIE-1α及其突變型HIF-1αAla564基因的重組腺病毒載體Adeno-HIF-1α及Adeno-HIF-1

5、αAla564，為進(jìn)一步研究HIF-1α基因及其突變型對(duì)缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法采用體外連接的重組腺病毒方法，由表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α及pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1αAla564通過(guò)KpnⅠ、XbaⅠ雙酶切獲得包括起始密碼子在內(nèi)的HIF-1α及HIE-1αAla564的cDNA片段，通過(guò)pcDNA3.1(+)分別克隆至穿梭質(zhì)粒pShuttle2的人

6、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(hCMV)和SV40多聚腺苷酸尾(polyA)之間的多克隆位點(diǎn)間，以PI-SceⅠ和Ⅰ-CeuⅠ雙酶切重組穿梭質(zhì)粒，獲得含有HIF1α及其突變型cDNA的表達(dá)盒，通過(guò)體外連接法與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒Adeno-XViralDNA連接，重組成pAdeno-HIF1α及pAdeno-HIF1αAla564腺病毒質(zhì)粒，再分別經(jīng)PacⅠ酶切線性化并暴露其兩端的反向重復(fù)序列(ITRs)，純化后以Lipofectamine200

7、0轉(zhuǎn)染低代HEK293細(xì)胞，包裝出帶有目的基因表達(dá)盒的重組腺病毒Adeno-HIF1α及Adeno-HIF1αAla564。同時(shí)重組腺病毒對(duì)照質(zhì)粒pAdeno-laZ，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，行X-gal原位細(xì)胞染色觀察轉(zhuǎn)染效率。重組病毒行PCR鑒定、擴(kuò)增及滴度測(cè)定。 結(jié)果經(jīng)酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)重組穿梭質(zhì)粒及重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功，pShuttle2-HIF1α及pAdeno-HIF1α質(zhì)粒中HIF1αcDNA564位均為脯氨酸

8、(Pro)密碼子CCC，而突變型pShuttle2-HIF1αAla564及pAdeno-HIF1αAla564質(zhì)粒564位則為丙氨酸(Ala)密碼子GCC。對(duì)照質(zhì)粒pAdeno-laZ轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞X-gal染色顯示轉(zhuǎn)染效率約20％。包裝后反復(fù)凍融細(xì)胞3次得到含重組病毒的病毒液，擴(kuò)增病毒后提取病毒DNA行PCR檢測(cè)重組腺病毒均得到預(yù)期的287bp擴(kuò)增產(chǎn)物，終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)重組腺病毒Adeno-HIF1α和Adeno-HIF1α