大鼠Foxo3a基因的克隆及其重組腺病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢功能早衰(Premature ovarian Failure,POF)是多種病因所致的卵巢功能衰竭,發(fā)生于青春發(fā)育后至40歲以前的婦女,以閉經(jīng)為主要臨床表現(xiàn),并伴有血清雌二醇水平下降和促性腺激素水平上升。卵巢早衰在臨床上可出現(xiàn)岡雌激素低落而發(fā)生的潮熱、出汗、情緒不穩(wěn)定、疲乏、記憶力下降等神經(jīng)精神癥狀以及閉經(jīng)、外陰干燥、疼痛、尿頻、尿急等生殖泌尿道萎縮刺激癥狀和其他相應(yīng)的臨床癥狀。因缺少雌激素的保護(hù),有患者可

2、能會(huì)出現(xiàn)心腦血管疾病和骨質(zhì)疏松等伴發(fā)疾病。且大多數(shù)POF患者要受到不孕癥的困擾。特別是對(duì)有生育要求的POF患者,這將給她們帶來精神和身體上的極大痛苦。實(shí)驗(yàn)室檢查可以發(fā)現(xiàn)POF患者血中FSH和LH持續(xù)在40IU/L以上,FSH升高更明顯,雌二醇(E2)常低于50～70pmol/L。經(jīng)陰道超聲檢查可見POF患者子宮、卵巢小于生育期婦女,卵巢內(nèi)無卵泡存在或雖有卵泡存在、但數(shù)目很少,卵泡直徑很少在10mm以上,連續(xù)監(jiān)測(cè)無卵泡發(fā)育及成熟。

3、　　 POF的病因復(fù)雜,目前認(rèn)為POF的發(fā)病與自身免疫功能異常、染色體異常、遺傳因素、代謝異常、醫(yī)源性及感染性因素等有關(guān)。近年來,惡性腫瘤的發(fā)病率呈持續(xù)升高,因化療而導(dǎo)致卵巢功能低下和不孕的患者日漸增多,成為POF發(fā)病的一個(gè)重要因?yàn)?化療藥物具有明確的卵巢毒性,主要通過誘導(dǎo)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡,使卵泡閉鎖,發(fā)生POF。現(xiàn)階段POF的治療常儀以雌孕激素替代治療和輔助生育技術(shù)為主,可以暫時(shí)緩解患者的更年期癥狀,但這些治療方法并不能從

4、根本上治療POF,且常年應(yīng)用還可能帶來嚴(yán)重的副作用。隨著惡性腫瘤患者年輕化及化療后患者存活率的提高,尋找新的治療途徑已成為婦產(chǎn)科醫(yī)務(wù)人員的迫切任務(wù)。
　　 Foxo3a是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族“O”組成員之一,近年研究發(fā)現(xiàn),Foxo3a基因是一個(gè)調(diào)節(jié)及抑制卵巢中卵泡活化的關(guān)鍵基因。其主要通過P13K途徑起作用,Akt被激活后,Foxo3a出核而失去轉(zhuǎn)錄活性。Foxo3a功能完全缺乏會(huì)導(dǎo)致大量始基卵泡的活化,隨之開始出現(xiàn)性成熟,進(jìn)一步會(huì)

5、使卵泡過早的耗竭,導(dǎo)致卵巢早衰和不孕癥的發(fā)生。Foxo3a也能增強(qiáng)周期抑蛋白的表達(dá)使細(xì)胞周期停止于G0/G1期。女性的生育期限由出生時(shí)原始卵泡池的大小和儲(chǔ)備量以及出生后卵泡閉鎖的速率所決定。卵巢早衰的婦女,無論是遺傳因素還是醫(yī)源性因素,根本因?yàn)闉槭蓟雅莸倪^度耗竭,因此,如果能上調(diào)Foxo3a基因,不僅能抑制卵泡活化,保存生育功能,還能使細(xì)胞停在相對(duì)靜止的細(xì)胞間期,降低化療藥對(duì)其的損害作用。
　　 近年來,分子生物學(xué)領(lǐng)域取得了迅

6、猛發(fā)展,基因治療作為一種新的醫(yī)療手段,為人類疾病治療開辟了一條新的途徑。如何安全地轉(zhuǎn)移治療基因,使其在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)是基因治療的關(guān)鍵。在眾多的病毒載體中,腺病毒倍受關(guān)注,因有以下五大優(yōu)點(diǎn),使其在臨床上得到廣泛應(yīng)用。①既可以感染分裂期細(xì)胞,又可以感染非分裂期細(xì)胞；②外源基因表達(dá)水平高；③病毒滴度高,制備純化相對(duì)容易；④插入外源基因容量大；⑤病毒基因組較少發(fā)生重排。其中應(yīng)用最多的是人5型腺病毒(Ad5)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesench

7、ymal stem cells,MSCs)是存在于骨髓微環(huán)境中的一種成體干細(xì)胞,具有不可忽視的優(yōu)點(diǎn),具有多向分化潛能,取材方便,能在體外大量擴(kuò)增,可行自體移植,避免了免疫排斥反應(yīng)及倫理道德等問題,因而具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題擬通過分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù),利用改進(jìn)的攜帶綠色熒光蛋白的AdEasy-1腺病毒載體系統(tǒng),構(gòu)建攜帶大鼠Fox03a基因的重組腺病毒,包裝、擴(kuò)增、純化后,體外感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,為進(jìn)一步探討利用Foxo3a進(jìn)行卵巢

8、早衰的基因治療提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 為深入研究Foxo3a基因治療化療性卵巢早衰的可行性與有效性,我們擬應(yīng)用AdEasy-1腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建包含大鼠Foxo3a基因的缺陷型腺病毒質(zhì)粒,利用相應(yīng)的包裝細(xì)胞系,制備具有感染能力的腺病毒顆粒,并感染有多分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,為進(jìn)一步研究Foxo3a基因在化療性卵巢早衰動(dòng)物模型上的治療作用打下基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1.提取大鼠脾臟總RN

9、A,運(yùn)用重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(Overlap-PCR)方法,設(shè)計(jì)特定限制性酶切位點(diǎn),合成大鼠。Foxo3a基因編碼區(qū)全長序列,亞克隆至pMD19-T載體中,用堿裂解法提取質(zhì)粒,對(duì)含目的片段的陽性重組克隆進(jìn)行全序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果均通過互聯(lián)網(wǎng)用Advanced BLAST2.0軟件與GenebBank中的大鼠Foxo3a-cDNA序列進(jìn)行同源性分析。
　　 2.將測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒大量擴(kuò)增并純化,經(jīng)Xbal及KpnI兩種特異性酶

10、切后定向克隆到攜帶綠色熒光蛋白(green fluorecence protein,GFP)的AdEasy-1系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-fox。Pme Ⅰ酶切pAdTrack-fox后轉(zhuǎn)化至含有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行同源重組,獲得重組腺病毒質(zhì)粒。
　　 3.將重組腺病毒質(zhì)粒線性化后,通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,得到

11、包含大鼠Foxo3a基因的完整腺病毒顆粒Ad-fox,通過氯化銫密度梯度離心法加以純化后,用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50法)測(cè)定其病毒滴度。提取病毒液的總RNA,運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)病毒中Foxo3a基因mRNA的轉(zhuǎn)錄。
　　 4.將攜帶Foxo3a基因的腺病毒感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,RT-PCR法檢測(cè)Foxo3a的mRNA表達(dá)情況,臺(tái)盼蘭檢測(cè)感染后細(xì)胞活力,運(yùn)用MTT方法檢測(cè)Ad-fox感染后的MSCs細(xì)胞增殖情

12、況,并繪制生長曲線。
　　 結(jié)果
　　 1.從大鼠脾臟組織中提取的總RNA,瓊脂糖凝膠電泳,可見3條清晰的RNA帶(28S、18S與5S),反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳,可見約2019bpDNA條帶,與預(yù)期的結(jié)果相符。重組陽性克隆酶切后電泳得到2019bp和2700bp條帶,提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析,同源性為99.9％。證實(shí)成功得到編碼大鼠Foxo3a蛋白的基因片段。
　　

13、2.將大鼠Foxo3a基因插入重組病毒載體中。經(jīng)特異性酶切反應(yīng)鑒定,證實(shí)重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-fox構(gòu)建成功。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,所獲得目的基因序列與已發(fā)表的大鼠Foxo3a基因序列相比,有兩個(gè)堿基發(fā)生突變,但其編碼的蛋白序列與GenBank中大鼠Foxo3a.蛋白質(zhì)序列完全一致,屬于沉默突變型,不影響后續(xù)表達(dá)。
　　 3.重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-fox大量擴(kuò)增純化后,在體外利用脂質(zhì)體2000成功轉(zhuǎn)染病毒包裝

14、細(xì)胞HEK293,最早在轉(zhuǎn)染后24小時(shí),在熒光顯微鏡下可見GFP的表達(dá)；約在轉(zhuǎn)染后14天,大部分HEK293細(xì)胞胞體固縮、懸浮,收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行PCR鑒定,得到預(yù)期2019bp大小的Foxo3a基因條帶,證實(shí)重組腺病毒Ad-fox已包裝成功。利用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測(cè)得,擴(kuò)增純化后獲得的重組腺病毒Ad-fox滴度(Titer)為1.2×10-10pfu/ml。
　　 4.采用不同MOI的病毒液感染大鼠骨髓間充

15、質(zhì)干細(xì)胞,感染后培養(yǎng)48h在熒光顯微鏡下觀察其感染效率,結(jié)果可見:當(dāng)MOI為10時(shí),僅有10％左右的細(xì)胞有熒光表達(dá):當(dāng)MOI為100時(shí),約有90％以上的細(xì)胞GFP表達(dá)陽性,且細(xì)胞形態(tài)與未感染細(xì)胞相同。用RT-PCR法檢測(cè)到被感染的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Fox03amRNA的表達(dá),MTT法測(cè)得最佳MOI感染細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的生長曲線無明顯差異。
　　 結(jié)論
　　 1.本實(shí)驗(yàn)成功克隆了大鼠Foxo3a基因,為進(jìn)一步研究Foxo

16、3a cDNA的基因功能及進(jìn)行基因治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.成功構(gòu)建了攜帶人鼠Foxo3a基因融合綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒載體,并包裝出高滴度、高純度的腺病毒。
　　 3.攜帶Foxo3a基因的重組腺病毒載體感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后,Foxo3a基因有效進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄,在MOI值為100時(shí)感染效率達(dá)90％,細(xì)胞具有最佳的生長狀態(tài),且細(xì)胞活力及細(xì)胞增殖曲線無明顯改變。本研究為進(jìn)一步探討利用Foxo3a進(jìn)行卵巢早衰的基因