pcDU6質(zhì)粒載體介導轉(zhuǎn)化生長因子β-,1-shRNA抑制人腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)化生長因子β-,1-的表達.pdf

1、目的:構(gòu)建能表達TGF-β<,1> shRNA的pcDU6質(zhì)粒載體.研究puDU6質(zhì)粒載體介導的TGF-β<,1> shRNA對人腹膜間皮細胞TGF-β<,1> 表達的影響,并比較TGF-β<,1> shRNA與反義TGF-β<,1> shRNA對人腹膜間皮細胞TGF-β<,1>表達的抑制作用.方法:構(gòu)建TGF-β<,1> shRNA的pcDU6質(zhì)粒載體,首先從TGF-β<,1> 基因中篩選出2個21個堿基大小的片段,分別設計2對寡核苷

2、酸,第1對退火后形成雙鏈,兩端帶有ApaI和BamHI酶切位點,第2對寡核苷酸退火后形成雙鏈,兩端帶有BamHI和HindIII酶切位點,將上述兩對寡核苷酸依次連入pcDU6載體(帶有U6啟動子的pcDNA3.1(-)載體).其2對DNA雙鏈通過BamHI酶切位點連接后形成中間由6個堿基序列間隔的反向互補序列,構(gòu)建成能產(chǎn)生TGF-β<,1> shRNA的質(zhì)粒載體.采用胰蛋白酶消化法從人腹膜組織中分離出腹膜間皮細胞進行體外培養(yǎng),并建立穩(wěn)定

3、的腹膜間皮細胞培養(yǎng)模型.然后將表達TGF-β<,1> shRNA的pcDU6質(zhì)粒載體和表達反義TGF-β<,1> RNA的pcDNA3.1(-)的質(zhì)粒載體分別采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染進入高糖(4.25％葡萄糖)和細菌脂多糖(LPS)刺激下的第3代人腹膜間皮細胞.HPMCs中TGF-β<,1> mRNA的表達采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(Reverse Transcription-PCR,RT-PCR)半定量分析.HPMCs培養(yǎng)液中TGF-β<