擬南芥AtCPK30基因的表達(dá)模式和功能分析.pdf

1、鈣是真核生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中普遍存在的第二信使。植物中各種各樣的信號(hào)都調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平，如激素、光、協(xié)迫等。關(guān)于鈣離子介導(dǎo)的信號(hào)是如何特異地傳遞是一個(gè)重要的生物學(xué)問(wèn)題，目前研究表明，似乎是不同的刺激引起不同的鈣識(shí)別物，而鈣信號(hào)中的傳遞因子能夠識(shí)別這些特異的鈣識(shí)別物，并將這種信號(hào)傳遞到下游從而發(fā)揮作用，包括改變蛋白的磷酸化作用和基因的表達(dá)模式。 鈣依賴(lài)蛋白激酶（CDPKs）廣泛存在于植物體內(nèi)，目前發(fā)現(xiàn)，大多的鈣信號(hào)傳遞都與鈣依賴(lài)蛋

2、白激酶有關(guān)。作為鈣信號(hào)途徑中一個(gè)傳遞因子，它參與了包括激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在內(nèi)的很多傳遞過(guò)程。本工作在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)擬南芥的一個(gè)鈣依賴(lài)蛋白激酶基因（AtCPK30）進(jìn)行了深入的研究。具體研究結(jié)果如下： 為了便于實(shí)驗(yàn)中T-DNA插入突變體的篩選，首先制作了一種簡(jiǎn)易可行的擬南芥水培裝置。這套裝置主要由兩部分組成：播放種子的塑料管和作為支撐物的不銹鋼絲網(wǎng)，盛溶液的容器。實(shí)驗(yàn)表明：T-DNA插入突變體在這種水培裝置中生長(zhǎng)良好，且培養(yǎng)的

3、費(fèi)用低，易于管理等。由于有鋼絲網(wǎng)作支撐，植株能夠順利完成整個(gè)生長(zhǎng)周期并且結(jié)實(shí)飽滿，種子萌發(fā)率高。并采用“雙引物法”篩選到了多個(gè)T-DNA插入突變體純合子，為進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。 接下來(lái)進(jìn)行了AtCPK30基因的表達(dá)模式研究。收集野生型擬南芥根、莖、葉、花、果，通用半定量RT-PCR分析組織表達(dá)特異性。結(jié)果表明：AtCPK30在植物根中有很高的表達(dá)量，而在其它組織表達(dá)較低。將生長(zhǎng)三周的野生型幼苗分別用植物激素脫落酸(ABA)、

4、吲哚乙酸(IAA)、2,4-二氯苯氧乙苯酸(2,4-D)、赤霉素(GA3)和6-芐氨基嘌呤(BA)處理，然后采用半定量RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)分析AtCPK30基因在幼苗中的轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AtCPK30基因的表達(dá)受ABA、IAA、2,4-D、GA3和BA等激素的誘導(dǎo)。 又通過(guò)基因克隆構(gòu)建了AtCPK30基因的植物超表達(dá)載體。并將此質(zhì)粒利用基因槍法轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞中，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，了解AtCPK30基因的亞細(xì)

5、胞定位情況。結(jié)果證明AtCPK30蛋白定位在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上。 同時(shí)將超表達(dá)載體通過(guò)浸花蕾法轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，得到了AtCPK30基因超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系純合子。測(cè)量在同一MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的野生型和轉(zhuǎn)基因植株幼苗主根長(zhǎng)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株主根在幼苗生長(zhǎng)前期比野生型的長(zhǎng)，但在第11天時(shí)，這種差異不明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株幼苗的根在缺鈣的MS培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較野生型植株好，表明缺鈣對(duì)轉(zhuǎn)基因幼苗影響較小。以野生型為對(duì)照，用植物激素ABA和