羧肽酶B在畢赤酵母中的表達、純化與活性鑒定.pdf

1、　　羧肽酶B(CPB)是一類水解蛋白或多肽底物C-端Lys或Arg的金屬蛋白酶。當(dāng)前，羧肽酶B已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽的末端修飾，急性胰腺炎及胰腺植皮排斥的血清標(biāo)記，尤其在胰島素原活化為胰島素的過程中，羧肽酶B是不可缺少的雙酶(胰蛋白酶及羧肽酶B)之一。到目前為止，商業(yè)途徑獲得的羧肽酶B主要從豬胰臟中提取，使得產(chǎn)品價格昂貴，同時也不可避免地混雜有其它蛋白酶，如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶。本研究的目的就是試圖以基因工程的方法生產(chǎn)一種高效價廉的

2、重組CPB產(chǎn)品?！　”緦嶒炌ㄟ^分析鼠proCPB的基因序列，比較其密碼子的組成與酵母偏愛密碼子的差異，在引物設(shè)計時采用基因改構(gòu)及密碼子優(yōu)化的策略，對鼠proCPB基因的5'序列進行了優(yōu)化。實驗時以RT-PCR法從SD鼠胰腺細胞中克隆了proCPB基因，將其插入pPIC9載體后，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115細胞，在醇氧化酶1(AOX1)強啟動子的作用下，首次實現(xiàn)了鼠羧肽酶原B蛋白在畢赤酵母中的表達，并在α-因子信號肽的引導(dǎo)下成功地分泌到胞外。

3、通過表達條件的優(yōu)化，使用BMGY(pH6.0)培養(yǎng)基，添加0.5﹪(m/v)的酪蛋白水解物和3mmol/L的PMSF，于28℃培養(yǎng)，每隔12h補加0.5﹪(v/v)的甲醇，重組酵母GS115-proCPB表達的重組蛋白可達500mg/L以上，表達的目的蛋白占總蛋白的94﹪以上。表達產(chǎn)物經(jīng)過二步疏水、二步離子交換層析及活化后，每升培養(yǎng)基可獲得50mg以上重組CPB產(chǎn)品，得到的CPB純度達95﹪以上?；钚詼y定表明，重組proCPB活化后的C