人組織因子途徑抑制因子（TFPI）在畢赤酵母中的表達(dá)與純化.pdf

1、　　血漿中TFPI含量很低，只有約50-70ug/L。為了得到大量TFPI用于功能研究及臨床應(yīng)用，利用基因工程的方法生產(chǎn)重組TFPI是較好的選擇。然而TFPI結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在許多表達(dá)體系中都未能實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量的表達(dá)。利用釀酒酵母表達(dá)體系表達(dá)TFPI產(chǎn)量很低，約20ug/L。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系所獲得的重組蛋白，產(chǎn)量約2～6mg/L，生物活性較好，但成本太高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來倍受重視的新型嗜甲醇酵母表達(dá)體系，它表達(dá)外

2、源蛋白產(chǎn)量高，操作簡單，利于發(fā)酵培養(yǎng)，并且與釀酒酵母相比，它對(duì)外源蛋白的修飾作用更近似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在畢赤酵母表達(dá)體系中，外源基因的表達(dá)量主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。人TFPI-cDNA第421-431位堿基序列為TATTTTTATA，有文獻(xiàn)報(bào)道在畢赤酵母宿主菌中，此序列可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止。　　為了在畢赤酵母中高效表達(dá)人組織因子途徑抑制因子，利用OE-PCR定點(diǎn)突變技術(shù)將TFPI-cDNA第421-431位堿基序列突變?yōu)門ACTTCT

3、ACA，將上述突變體及野生型cDNA分別插入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9中，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌GS115，KM71，同時(shí)轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pPIC9作為表達(dá)陰性對(duì)照。上述三個(gè)轉(zhuǎn)化子經(jīng)0.5％的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，利用底物顯色法定量地檢測培養(yǎng)上清中TFPI的含量，篩選出表達(dá)量較高的菌株用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。隨后對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。培養(yǎng)上清經(jīng)超濾濃縮后，依次用DEAE-SepharoseFastFlow及Heparin-sepharoseCL6B柱層析分離純化得到