剩余污泥酶法水解制備蛋白質(zhì)、氨基酸及其機(jī)理研究.pdf

1、剩余污泥(excess sludge，ES)有機(jī)成分中含量最高的是微生物單細(xì)胞蛋白質(zhì)，而微生物單細(xì)胞蛋白質(zhì)是品質(zhì)好、氨基酸種類齊全的高價(jià)值飼料，但尚未得到充分利用。如果應(yīng)用大量剩余污泥為原料，運(yùn)用現(xiàn)代食品、生物加工技術(shù)，對(duì)污泥蛋白資源進(jìn)行精細(xì)加工，生產(chǎn)出動(dòng)物飼料添加劑，既可綜合利用大宗蛋白質(zhì)資源，避免和減少資源的浪費(fèi)，提高剩余污泥的附加值;另一方面將ES蛋白應(yīng)用于動(dòng)物飼料中，又?jǐn)U大了優(yōu)質(zhì)氨基酸的來源問題。
　　從污泥中提取蛋白質(zhì)和

2、氨基酸的研究方法為酸水解、堿水解法及其超聲波輔助法，但還存在固定投資大，資金回收周期長(zhǎng)，反應(yīng)條件劇烈，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求較高，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，且水解產(chǎn)物極易發(fā)生構(gòu)型改變從而造成水解產(chǎn)物成分極為復(fù)雜和蛋白特性變化，導(dǎo)致水解蛋白不能被生物體吸收利用。另外堿性水解易引起幾種氨基酸結(jié)構(gòu)變化或外消旋化。水解產(chǎn)生的廢水處理需要大量的酸堿，處理費(fèi)用高。
　　本課題針對(duì)上述問題，選用蛋白酶水解剩余污泥提取蛋白質(zhì)，并將其有效轉(zhuǎn)化為氨基酸，產(chǎn)品純度較

3、高且質(zhì)量高于國家有關(guān)動(dòng)物飼料標(biāo)準(zhǔn)。此外，利用氧化石墨烯固定化酶反應(yīng)條件溫和、溫度低、對(duì)蛋白質(zhì)的破壞作用小等特點(diǎn)，發(fā)明一套可循環(huán)利用并提高蛋白質(zhì)水解率的固定酶酶解方法，利用異硫氰酸苯酯(PITC)高效液相色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)水解蛋白質(zhì)、氨基酸進(jìn)行分離純化和鑒定，利用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理探討水解參數(shù)與固定酶深度酶解速度之間的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上探索深度酶解的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和機(jī)理，并對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸提取物進(jìn)行重金屬含量及多環(huán)芳烴(PAHs)含量分析

4、、動(dòng)物急慢性毒理學(xué)研究。
　　論文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)剩余污泥主要成分及利用價(jià)值分析
　　對(duì)選取的ES樣品進(jìn)行了主要有機(jī)組分成分分析，發(fā)現(xiàn)干物質(zhì)ES中有機(jī)質(zhì)占73.85％，其中脂肪含量約為0.6％，總糖含量為10.2％，蛋白質(zhì)含量58.1％，此剩余污泥樣品應(yīng)用于提取蛋白質(zhì)具有可行性。
　　(2)蛋白酶優(yōu)選及剩余污泥的水解
　　考察了木瓜、堿性、中性、酸性、胰以及胃蛋白酶六種不同蛋白酶對(duì)ES

5、蛋白質(zhì)的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶提取ES中蛋白質(zhì)提取率最高。其次為中性蛋白酶和木瓜蛋白酶，胃蛋白酶、酸性蛋白酶和胰蛋白酶的提取效果較差。對(duì)堿性蛋白酶水解剩余污泥提取蛋白質(zhì)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了不同影響因素，得到堿性蛋白酶最適工作條件為:pH值為8.0，溫度55℃，加酶量為2％，反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)，液固比4∶1。在此工作條件下，52.5％的蛋白質(zhì)被提取出來，占干污泥重量的30.5％。
　　(3)酶水解剩余污泥機(jī)理分析
　　

6、利用SDS-PAGE考察了污泥中蛋白質(zhì)分布情況，結(jié)果表明，不同提取方法的SDS-PAGE蛋白質(zhì)條帶不同，酶法水解ES蛋白質(zhì)分子量范圍大約在14-100kDa;通過Michaelis-Menten方程，采用雙倒數(shù)作圖法繪圖，得到堿性蛋白酶催化水解污泥蛋白反應(yīng)的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率分別為Km=34.9 g/L，Vmax=32.2g/(L·min)。以堿性蛋白酶水解污泥蛋白水解度為參數(shù)，推導(dǎo)出反映酶法水解污泥蛋白動(dòng)力學(xué)模型，所建立的模型在一

7、定程度上能模擬水解體系的酶解過程，能較準(zhǔn)確地計(jì)算出堿性蛋白酶酶解ES蛋白的水解度，理論DH值與實(shí)際DH值基本吻合，對(duì)酶解過程的實(shí)際應(yīng)用具有很高的利用價(jià)值。
　　(4)酶法水解制取氨基酸的分析
　　PITC柱前衍生反相高效液相色譜法可以在35min內(nèi)同時(shí)分析18種氨基酸，18種氨基酸得到完全分離，相鄰氨基酸峰之間均達(dá)到基線分離。說明該方法應(yīng)用在分離氨基酸溶液具有較好的專屬性。利用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生反相高效液相色譜

8、法檢測(cè)酶法水解污泥氨基酸溶液含有17種氨基酸，分別為必需氨基酸7種和非必需氨基酸10種。人體所必需氨基酸含量高達(dá)40％，說明酶法水解剩余活性污泥制備的氨基酸作為家禽家畜飼料應(yīng)用價(jià)值高。
　　(5)蛋白酶固定化及酶學(xué)性質(zhì)考察
　　以氧化石墨烯為基底材料，對(duì)堿性蛋白酶進(jìn)行固定化，得到固定化的最優(yōu)組合，即當(dāng)溫度為25℃，pH值為8，酶用量為600μL，戊二醛濃度2％時(shí)，堿性蛋白酶酶活力回收率可達(dá)90％左右;同時(shí)對(duì)固定化蛋白酶最適工

9、作條件進(jìn)行了考察，固定酶的最適工作條件是，體系pH為8，溫度60℃;考察了固定化酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性以及重復(fù)使用性。同時(shí)確定了以酪蛋白為底物時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，動(dòng)力學(xué)分析得到游離酶和固定酶的Km常數(shù)分別是4.85和8.57 mg/mL，最大速率常數(shù)Vmax分別是5.7和6.10μg/min。固定酶的米氏常數(shù)是游離酶的1.8倍。
　　(6)固定酶水解制備氨基酸的研究
　　考察了氧化石墨烯固載酶體系水解ES蛋白影響因

10、素，在溫度為65℃，pH值為10，酶用量8 mg/mL，時(shí)間為6h條件下，氧化石墨烯固載酶水解剩余污泥氨基酸結(jié)果達(dá)到8.23 g/100g DS。固定酶與游離酶對(duì)剩余污泥粗蛋白質(zhì)的水解效果幾乎一樣，水解得到的總氨基酸分別是8.23和10.154 g/100g DS。從XRD、XPS、SEM、AFM以及TGA等表征手段分析得出:堿性蛋白酶通過戊二醛交聯(lián)法已經(jīng)成功地固載在氧化石墨烯載體上，并且可以了解氧化石墨烯-堿性蛋白酶復(fù)合材料的穩(wěn)定性能

11、。
　　(7)污泥水解產(chǎn)品中重金屬和持續(xù)性有機(jī)污染物的分析及對(duì)錦鯉的急性毒理學(xué)
　　考察了污泥及蛋白質(zhì)制品中重金屬微量元素(Cu，Ni，Zn，F(xiàn)e，Mn)和有害重金屬(Pb，Cr，Cd，Hg，As)等金屬的含量，發(fā)現(xiàn)污泥中鐵的含量非常高，達(dá)到10247.59 mg/kg DS。另外，污泥中除鋅含量超標(biāo)外，基本都在1984年頒布的《農(nóng)用污泥中污染物控制標(biāo)準(zhǔn)》(GB4284-84)的限值之內(nèi)。酶法污泥蛋白提取液中重金屬微量元素析

12、出量和有害重金屬浸出量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于堿法、酸法提取污泥蛋白。酶法提取污泥蛋白質(zhì)中有害重金屬Pb、Cr、Cd、Hg、As的含量均低于飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB13078-2001)，其中Pb浸出率最高。
　　經(jīng)微波消解、固相微萃取后，采用GC/MS分析方法，檢測(cè)了污泥、三種不同方法提取的污泥蛋白及酶提污泥蛋白飼喂錦鯉魚體內(nèi)的18種多環(huán)芳烴含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿法提取的污泥蛋白中，∑PAHs含量最高，酸法次之，酶法提取的污泥蛋白∑PAHs最少，最安全。

13、同時(shí)考察了酶法提取粗蛋白作為飼料的安全性，錦鯉體內(nèi)∑PAHs和致癌性多環(huán)芳烴(∑PAHscare)含量普遍比較低。
　　總之，本文選用ES為研究對(duì)象，利用堿性蛋白酶以及固定化堿性蛋白酶酶法水解為研究方法，系統(tǒng)研究了游離酶與固定酶酶法水解ES中蛋白質(zhì)、氨基酸，對(duì)其水解特性及水解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了深入探討。此外，重點(diǎn)考察了酶法提取ES粗蛋白中有毒有害金屬及重金屬、PAHs含量分析，以及ES粗蛋白應(yīng)用在錦鯉魚飼料上的初步研究。本研究為蛋白酶在