膠體金免疫層析法和熒光定量PCR聯(lián)合檢測(cè)沙門(mén)氏菌.pdf

1、目的：建立一套快速，準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)程序，應(yīng)用于人畜共患致病菌沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。 方法：《1)建立膠體金免疫層析法(gold immunochromatography assay，GICA)：利．用沙門(mén)氏菌免疫實(shí)驗(yàn)兔獲得高免血清，提純出沙門(mén)氏菌多克隆抗體：然后用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備34nm的膠體金顆粒，加入沙門(mén)氏菌多克隆抗體15ug/ml，制備出金標(biāo)抗體，再與硝酸纖維膜，羊抗兔抗體，玻璃纖維膜等材料結(jié)合制成試紙條，最后評(píng)價(jià)G

2、ICA的靈敏度和特異性，并在不同儲(chǔ)存條件下，測(cè)試GICA的穩(wěn)定性。(2)建立熒光定量PCR(fIuorescencer quantitive polymerasechain reaction，F(xiàn)Q-PCR)方法：根據(jù)沙門(mén)氏菌保守基因序列fimY基因設(shè)計(jì)合成引物和TaqMan探針，然后對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，最后評(píng)價(jià)FQ-PCR的靈敏度，特異性，和重復(fù)性。(3)運(yùn)用GICA和FQ-PCR對(duì)飼料，豬糞，肉制品等樣品進(jìn)行臨床檢測(cè)，同時(shí)采用傳

3、統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定方法比較結(jié)果。 結(jié)果：(1)GICA的沙門(mén)氏菌最低檢測(cè)量為2.3x10<'5>fu/ml，與大腸桿菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌等常見(jiàn)腸道菌不發(fā)生交叉反應(yīng)；放置4℃或37℃存放9個(gè)月，檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異；整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程僅需10～15 min即可判斷結(jié)果。12)FQ-PCR的檢測(cè)靈敏度達(dá)到4.5 cfu/反應(yīng)體系，比普通PCR高100倍；檢測(cè)非沙門(mén)氏菌均呈陰性，檢測(cè)沙門(mén)氏菌均呈陽(yáng)性：平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致性高，可重復(fù)性強(qiáng)。(3)通過(guò)

4、檢測(cè)臨床樣品，GICA和FQ-PCR相結(jié)合的方法與傳統(tǒng)方法所得結(jié)果相符合，但操作程序較為簡(jiǎn)便，操作時(shí)間大大縮短。 結(jié)論：綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定優(yōu)化的沙門(mén)氏菌檢測(cè)程序即對(duì)大量樣品采用GICA篩檢，除去大量陰性樣品，陽(yáng)性樣品采用FQ-PCR法作進(jìn)一步鑒定：需要定型時(shí)則用傳統(tǒng)方法。此法具有高度的特異性、敏感性和快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，為常年需處理大量樣品的動(dòng)檢、食品飼料監(jiān)測(cè)和防疫等部門(mén)提供一種有效的檢測(cè)手段。既可保證樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，