戊型肝炎病毒衣殼蛋白表位對病毒宿主嗜性的影響.pdf

1、戊型肝炎(Hepatitis E，HE)由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)所引起的病毒性肝炎。近年來，HEV已逐漸成為全球范圍內(nèi)引發(fā)急性病毒性肝炎的最主要原因之一。孕婦與老年人是主要高危人群。戊型肝炎病例的病死率約為0.2～4％，孕婦感染HEV的病死率可高達10～25％。HEV是單股正鏈RNA病毒，基因組全長7.2kb，包含3個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），其中ORF2負責編碼戊型

2、肝炎病毒唯一的衣殼蛋白，共包含660個氨基酸，該蛋白參與了病毒組裝、免疫及病毒細胞相互作用。
　　HEV被分為4種基因型。基因1、2型HEV目前主要發(fā)現(xiàn)于人類及非人靈長類感染，常見于由于水源的污染在熱帶和亞熱帶地區(qū)引發(fā)大規(guī)模的爆發(fā);而基因3、4型戊型肝炎病毒除了感染人及非人靈長類外，還被廣泛發(fā)現(xiàn)于多種動物宿主中（包括:家豬、野豬、鹿、山羊、綿羊、駱駝、蝙蝠和貓鼬），常見于散發(fā)病例，主要通過食源污染引發(fā)，以家豬為主要的感染宿主和傳播

3、載體。由于絕大部分HEV毒株在體外細胞培養(yǎng)中不能有效復制，同時實驗室常用小動物模型（小鼠、大鼠、兔等）對HEV的主要流行毒株也不敏感，不同基因型間宿主嗜性與流行差異的分子基礎(chǔ)等重要分子機制一直未能得到清楚的闡明。
　　HEV的衣殼蛋白作為裸病毒的最外層的蛋白參與了病毒與宿主細胞的相互識別、感染和誘發(fā)宿主免疫應答等許多過程。本研究基于識別HEV衣殼蛋白的抗體盤中一株特異性識別基因3、4型HEV的單抗6H8，通過解構(gòu)6H8與HEV衣殼

4、蛋白的免疫復合物結(jié)構(gòu)，鑒定了一個基因3、4型戊HEV特異性表位及其構(gòu)象基礎(chǔ)，分析鑒定了導致表位特異性的關(guān)鍵氨基酸，并通過自己建立的細胞及動物研究模型驗證了關(guān)鍵氨基酸對HEV基因型間宿主差異的影響，從分子機制上闡述了導致基因型間宿主差異的關(guān)鍵原因之一。
　　首先，本研究鑒定了一株特異性與基因3、4型病毒反應的抗體6H8。通過解析該抗體與4型HEV衣殼蛋白二聚體復合物的結(jié)構(gòu)鑒定了6H8與衣殼蛋白反應的相互作用界面。復合物結(jié)構(gòu)顯示1個H

5、EV衣殼二聚體E2s結(jié)合兩個6H8Fab，6H8 Fab分子結(jié)合在抗原二聚體的頂部兩側(cè)。參與6H8抗體反應的抗原表位區(qū)由481-493及530-533兩個loop環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)成，將該表位命名為表位Z。丙氨酸掃描結(jié)果顯示關(guān)鍵表面氨基酸為Gln482、Ser487、Ser488、Gln530、Gln531和Tyr532。通過比較不同基因型HEV在這兩個loop區(qū)的氨基酸序列進行比較，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的483、490和492這三個位點在靈長類感染組（基

6、因1、2型HEV）和動物感染組(基因3、4型HEV)存在穩(wěn)定的差異，基因1、2型HEV上為Ser483、Gly490和Va1492，基因3、4型上為Thr483、Asn490和Met492。突變體蛋白反應性實驗結(jié)果確定Asn490為6H8抗體與基因3、4型HEV反應的關(guān)鍵氨基酸，而Met492則起到環(huán)境氨基酸的作用。對4型HEV結(jié)構(gòu)的分析顯示出loop1上的Asn490能夠與loop2上的Tyr532形成穩(wěn)固的氫鍵，并由Met492填充

7、這兩個氨基酸下方的結(jié)構(gòu)空腔，來穩(wěn)定loop1和loop2，從而在病毒粒子表面穩(wěn)定展示出該表位Z。分子動力學模擬結(jié)果進一步支撐了該結(jié)論，1型HEV上的loop1與loop2的自由度要明顯高于4型HEV表面的相應位置。
　　同時本研究基于巴馬小型香豬建立了基因3、4型HEV特異性感染動物模型，通過原位灌流的方法成功分離了豬原代肝細胞并確定了合適豬原代肝細胞的體外培養(yǎng)條件，建立了基于豬原代肝細胞的體外研究模型。并構(gòu)建了HEV4型感染性克

8、隆，以及pORF2490、492位點突變的1、4型感染性克隆以用于后續(xù)研究。
　　在此基礎(chǔ)上，本研究驗證了上述發(fā)現(xiàn)的HEV3/4型特異性表位Z在病毒吸附及感染過程中的作用。類病毒顆粒與突變病毒在細胞吸附上的結(jié)果均顯示在基因1型病毒上將490位氨基酸由Gly突變?yōu)锳sn，492位點由Val突變?yōu)镸et，能夠重建基因1型病毒與豬原代肝細胞的結(jié)合入胞。而在基因4型病毒上將490位氨基酸由Asn突變?yōu)镚ly，492位點由Met突變?yōu)閂al

9、，能夠破壞基因4型病毒與豬原代肝細胞的結(jié)合入胞，甚至在類病毒顆粒上的結(jié)果顯示490單點在基因4型上的突變就能夠有效影響與豬原代肝細胞的結(jié)合入胞。這表明Asn490和Met492位點對于4型病毒識別并吸附豬肝來源細胞是至關(guān)重要的。
　　食蟹猴及小型香豬模型上進行的感染結(jié)果顯示幾種突變病毒均能夠成功感染食蟹猴，這表明表位Z并不影響病毒對靈長類的感染。而小型香豬模型上的結(jié)果則顯示出只有維持野生型基因的4型HEV能夠成功感染小型香豬，在基

10、因4型上490和492位點突變的HEV毒株則不能夠感染差異性宿主，說明表位Z確實參與了病毒對非靈長類動物的感染過程。但野生基因1型HEV毒株和基因1型上490和492位點突變的變異株均不能夠成功感染差異性宿主。造成這一結(jié)果的可能原因是導致基因1型HEV不能感染差異性宿主的原因不止于病毒和宿主細胞結(jié)合的差異，還存在其他因素導致了基因1型HEV不能非靈長類宿主。
　　綜上所述本研究提供了以下假說:基因3/4型HEV上的Asn490通過

11、與來源于另一個loop上的Tyr532之間形成穩(wěn)固的氫鍵，并由Met492填充這兩個氨基酸下方的結(jié)構(gòu)空腔，從而穩(wěn)定了由1oop481-492及l(fā)oop530-533構(gòu)成的一個特異性的展示在基因3、4型HEV衣殼頂部的表面位點。同時本研究還證實3/4型HEV正是通過這個特有的表位Z實現(xiàn)對豬來源的肝細胞的識別吸附和內(nèi)吞入胞，該表位是3/4型HEV感染非靈長類動物的重要機制之一。動物感染結(jié)果一方面進一步證實了該表位對3/4型HEV感染非靈長類