Rho A-ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化中的作用及法舒地爾的肝臟保護機制研究.pdf

1、肝纖維化（hepatic fibrosis）是多種病因所致的慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)，是慢性肝病轉(zhuǎn)化為肝硬化和肝功能衰竭的必經(jīng)階段和共同病理基礎(chǔ)，因此，預(yù)防、治療甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化是阻斷肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究證實肝纖維化是由于膠原合成、沉積與降解和吸收的動態(tài)平衡被破壞，使膠原的合成與沉積大于降解和吸收，致使細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix,ECM）過度沉積為典型特征，在這一過程中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)和細胞凋亡等病理生

2、理過程發(fā)揮了重要的作用。我國是肝病高發(fā)國家，目前尚無有效的抗肝病藥物，如何阻止或逆轉(zhuǎn)ECM過度沉積成為治療慢性肝病的關(guān)鍵，也是國內(nèi)外學(xué)者的研究重點。
　　Rho蛋白作為小分子的鳥苷酸結(jié)合蛋白，屬于Ras超家族成員，被稱為“分子開關(guān)”。ROCK是Rho A下游最主要的效應(yīng)分子，是絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶家族成員。近年來研究發(fā)現(xiàn)，激活的Rho A/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠介導(dǎo)細胞粘附與遷移、肌動蛋白骨架形成及細胞增殖和

3、凋亡等多種生物學(xué)功能，這些效應(yīng)在多種器官組織慢性炎癥纖維化中發(fā)揮了重大作用。有研究表明，選擇性阻斷該信號通路可以改善纖維化器官的進展和預(yù)后。法舒地爾作為唯一一種被應(yīng)用于臨床的Rho激酶選擇性抑制劑，主要用于預(yù)防蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣，改善由此引起的腦缺血癥狀，應(yīng)用后藥物迅速向肝、腎、脾和腸等組織中轉(zhuǎn)移，在上述組織中含量較高。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾可以抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高機體抗氧化能力，發(fā)揮對心肌的保護作用，但其在肝纖維化進程

4、中的作用機制目前尚不清楚。本研究擬采用代謝性疾病、化學(xué)因素及免疫性損傷三種不同因素所致的大鼠肝纖維化模型，應(yīng)用藥理學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等多種實驗方法來探討Rho A/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化中的作用，及法舒地爾對肝纖維化進展的影響及其可能的作用機制。
　　第一部分：Rho A/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對糖尿病大鼠肝纖維化模型炎癥反應(yīng)的影響及其機制研究
　　目的：
　　采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠為模型，探討

5、Rho A/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對肝纖維化的作用并觀察法舒地爾的抗炎抗纖維化效應(yīng)及其機制。
　　方法：
　　健康成年雄性SD大鼠（5～6周）共50只，隨機分為空白對照組和模型組。模型組一次性腹腔注射1％的STZ60 mg/kg，5日后斷尾取血，血糖≥15 mmol/L入組，表示造模成功。其中模型組分為：單純糖尿病組、Fas低劑量組、Fas高劑量組和卡托普利組，每組10只。分別給予等容積檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液、Fas2 mg/

6、kg/d、10 mg/kg/d，腹腔注射，卡托普利30 mg/kg/d灌胃。各組大鼠普通喂養(yǎng)8周后處死。測量體重、肝重，計算肝臟重量指數(shù)；常規(guī)檢測血清中AST、ALT和HbA1C；采用石蠟切片通過蘇木精伊紅染色法（H&E）和馬松三色法觀察肝臟的形態(tài)學(xué)變化；ELISA方法檢測肝臟組織炎癥指標TNF-α、IL-6變化；Western blot方法檢測肝臟組織中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、NF-κBp65和IκBα表達；RT-PC

7、R方法測定肝臟組織Collα1 mRNA，Rho A mRNA及Rock-1 mRNA含量。
　　結(jié)果：
　　1.正常對照組大鼠一般狀況好，而模型組大鼠出現(xiàn)典型的糖尿病“三多一少”表現(xiàn)。DM組大鼠的平均體重明顯低于NC組，下降了27.14%（P<0.05），而LW和LWI顯著增加（P<0.01）。高劑量法舒地爾（H-Fas）明顯減輕了大鼠體重的下降的趨勢，肝重增加的趨勢也明顯減輕（P<0.01）。
　　2.模型組大鼠的

8、ALT、AST、TNF-α、IL-6及糖化血紅蛋白含量明顯高于對照組（P<0.01），表明高血糖引起的一系列炎癥反應(yīng)，引起大鼠肝功能異常。法舒地爾治療后ALT、AST水平與模型組相比顯著降低，血清中TNF-α和 IL-6也有明顯降低（P<0.01），且高劑量組比低劑量組更有效?？ㄍ衅绽委熃M中上述指標較DM組也有明顯降低，但各治療組中HbA1C并無統(tǒng)計學(xué)區(qū)別。
　　3.H&E切片染色結(jié)果顯示模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細胞結(jié)構(gòu)紊

9、亂，炎細胞浸潤明顯，纖維組織增生，包繞匯管區(qū)。給予法舒地爾治療后，可見組織學(xué)變化明顯減輕，細胞排列趨于規(guī)則，炎細胞減少，纖維組織減少。馬松三色染色結(jié)果可見模型組膠原纖維大量增生，給予治療后，細胞外基質(zhì)大量減少，膠原纖維形成減少（P<0.05），且與給藥劑量呈依賴關(guān)系，高劑量Fas組效果更明顯（P<0.01）。
　　4.模型組大鼠的TGF-β1、TIMP-1表達水平顯著提高，MMP-9的表達明顯減少（P<0.01）。應(yīng)用法舒地爾治療

10、后，肝臟 TGF-β1、TIMP-1表達水平顯著降低，MMP-9表達相應(yīng)的增強。法舒地爾高劑量組的影響大于低劑量組（P<0.01）。研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝臟中NF-κBp65表達較正常對照組顯著增加，應(yīng)用法舒地爾治療后這種增加的趨勢明顯變緩。而 IκB的表達則呈現(xiàn)出相反的趨勢。
　　5.與正常對照大鼠相比，糖尿病大鼠肝臟組織中Collα1 mRNA表達顯著的增加，表明在糖尿病大鼠中肝臟纖維化已經(jīng)形成（P<0.01）。應(yīng)用法舒地爾治療

11、組的糖尿病大鼠肝臟中Collα1 mRNA較明顯減少，表明抗肝纖維化的代償機制被啟動。L-Fas組和H-Fas組中Rho A mRNA、ROCK-1 mRNA的表達均有不同程度的減少，表明Rho A/ROCK通路確實參與了糖尿病肝纖維化的過程，而這一抗纖維化作用與膠原的形成是緊密相聯(lián)的（P<0.01）。
　　第二部分：Rho A/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對四氯化碳所致大鼠肝纖維化模型凋亡的影響及其機制研究
　　目的：
　　

12、采用四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的模型，探討Rho A/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對肝纖維化的影響及法舒地爾的抗凋亡效應(yīng)及其作用機制。
　　方法：
　　健康成年雄性SD大鼠（5～6周），隨機分為空白對照組和模型組。模型組給予50% CCl4植物油混合液1 ml/kg腹腔注射，每周2次，給藥8周。其中模型組分為：單純 CCl4組、Fas低劑量組、Fas高劑量組和卡托普利組，每組10只。分別給予等容積緩沖液、Fas2 mg/kg/d、1

13、0 mg/kg/d，腹腔注射，卡托普利30 mg/kg/d灌胃。各組大鼠普通喂養(yǎng)8周后處死。測量體重、肝重，計算肝臟重量指數(shù)；常規(guī)檢測血清中AST及ALT；采用石蠟切片通過蘇木精伊紅染色法（H&E）和馬松三色法觀察肝臟的形態(tài)學(xué)變化；Western blot方法檢測Bcl-2和Bax表達；RT-PCR方法檢測肝臟組織caspase-3 mRNA，Rho A mRNA及ROCK-1mRNA含量。
　　結(jié)果：
　　1.模型組動物與

14、正常組大鼠相比出現(xiàn)明顯精神萎靡，反應(yīng)變慢，體毛干枯，體重下降。大鼠的平均體重明顯低于NC組，下降了29.34%（P<0.05），而LW和LWI顯著增加（P<0.01）。
　　2.模型組大鼠血清ALT、AST較對照組明顯升高（P<0.01），表明大鼠肝功能受損嚴重。法舒地爾治療后大鼠血清 ALT、AST明顯下降，其中低劑量組ALT、AST分別下降了25.47%和9.87%，高劑量組ALT、AST分別下降了45.34%和21.84%（

15、P<0.01），高劑量組下降趨勢明顯優(yōu)于低劑量組?？ㄍ衅绽委熃M大鼠血清ALT、AST較模型組有明顯降低（P<0.01）。
　　3.正常對照組可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞無脂肪變及炎細胞浸潤，無壞死和纖維組織增生。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞排列紊亂，明顯腫脹、變性?？梢姶笮〔坏鹊闹究张菪纬?，部分呈現(xiàn)氣球樣變，可見凋亡小體形成。匯管區(qū)大量淋巴細胞浸潤，中央靜脈偏位或缺如。肝小葉周圍明顯壞死，膠原增生顯著，并向肝小葉內(nèi)部延伸，部分粗

16、大纖維隔包繞肝細胞，假小葉形成。治療組未見假小葉形成，有纖維增生，且僅僅局限在匯管區(qū)，以肝細胞脂肪變性壞死為主。
　　4.Bcl-2/Bax的比率決定了細胞的生存或凋亡。模型組大鼠肝臟中，Bcl-2表達顯著降低下降而Bax表達顯著升高，Bcl-2/Bax比例降低，說明肝細胞凋亡增多（P<0.01）；而經(jīng)法舒地爾和卡托普利干預(yù)后，Bcl-2表達顯著升高，而Bax表達顯著降低，Bcl-2/Bax比值升高，表明上述藥物有效抑制凋亡。

17、r>　　5.模型組大鼠肝臟中 caspase-3 mRNA的表達較對照組顯著升高（P<0.01），Rho A mRNA和ROCK-1 mRNA表達均增加；法舒地爾干預(yù)組大鼠肝臟組織中 caspase-3 mRNA的表達較單純模型組大鼠顯著降低（P<0.05），Rho A mRNA和ROCK-1 mRNA表達均受到抑制，且高劑量組比低劑量組降低的更顯著，表明肝細胞的凋亡受到了抑制?？ㄍ衅绽M也有類似的降低表現(xiàn)。
　　第三部分：Rho

18、 A/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對豬血清所致大鼠肝纖維化模型氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及其機制研究
　　目的：
　　采用豬血清誘導(dǎo)的免疫性大鼠肝纖維化的模型，探討 Rho A/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對肝纖維化的作用及法舒地爾的抗氧化作用。
　　方法：
　　健康成年雄性SD大鼠（5～6周），隨機分為空白對照組和模型組。模型組給予豬血清0.5 ml/只腹腔注射，每周2次，給藥8周。其中模型組分為：單純豬血清組、Fas低劑量組、Fas

19、高劑量組和卡托普利組，每組10只。分別給予等容積緩沖液、Fas2 mg/kg/d、10 mg/kg/d，腹腔注射，卡托普利30 mg/kg/d灌胃。各組大鼠普通喂養(yǎng)8周后處死。測量體重、肝重，計算肝臟重量指數(shù)；常規(guī)檢測血清中AST及ALT；比色法測量肝臟組織勻漿中SOD活性和MDA含量；肝臟的形態(tài)學(xué)變化和纖維化程度采用石蠟切片通過蘇木精伊紅染色法（H&E）及馬松三色法進行觀察；采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定肝臟組織TGF-

20、β1 mRNA、Rho A mRNA及ROCK-1 mRNA含量。
　　結(jié)果：
　　1.模型組大鼠與正常組大鼠相比一般狀況相似，個別毛色較正常組略發(fā)黃，體重變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。模型組大鼠體重及肝臟重量變化不明顯，肉眼下肝臟與正常組大鼠肝臟類似（P>0.05）。
　　2.模型組大鼠血清ALT、AST較對照組明顯升高，分別增加了222.85%和273.34%（P<0.01），表明大鼠肝功能受損嚴重。法舒地爾治

21、療后大鼠血清ALT、AST明顯下降（P<0.01），且高劑量組下降趨勢明顯優(yōu)于低劑量組（高劑量組的ALT下降了52.93%，AST降低53.54%）?？ㄍ衅绽委熃M大鼠血清ALT、AST較模型組也有明顯降低（P<0.05）法舒地爾治療后大鼠肝功能明顯好轉(zhuǎn)（P<0.05），且呈劑量依賴性?？ㄍ衅绽委熃M大鼠血清ALT、AST較模型組有明顯降低（P<0.05）。
　　3.H＆E染色觀察顯示，給與低劑量或高劑量法舒地爾治療后，組織學(xué)改變

22、顯著減輕，表現(xiàn)為肝細胞排列規(guī)則，成纖維細胞和脂肪空泡減少。馬松染色結(jié)果顯示肝臟組織纖維化面積與法舒地爾給藥呈劑量依賴性，隨著給藥劑量的增加而縮小（P<0.05）。
　　4.模型組與正常對照組比較肝臟組織內(nèi)MDA含量明顯升高，增加了77.78%，SOD活性明顯降低（50.01%）（P<0.01）。與模型組比較，法舒地爾低、高劑量組肝臟組織MDA含量降低，SOD活性明顯升高。高劑量組改變更明顯，MDA含量降低了19.98%（P<0.0

23、5），SOD活性增加54.55%（P<0.01）；卡托普利治療組肝臟組織內(nèi)MDA含量降低（P<0.05），SOD活性明顯升高（P<0.01）。（見Table3、Fig.3、Fig.4）表明法舒地爾和卡托普利都發(fā)揮了抗氧化作用。
　　5.與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟組織中TGF-β1 mRNA表達顯著的增加（P<0.01）。應(yīng)用法舒地爾治療組的大鼠肝臟中TGF-β1 mRNA較明顯減少，表明抗氧化應(yīng)激的代償機制被啟動。法舒地爾組

24、中Rho A mRNA、ROCK-1 mRNA具有不同程度的表達減少，表明Rho A/ROCK通路確實參與了肝纖維化的過程。
　　結(jié)論：
　　1.高糖可以激活Rho A/ROCK通路，ROCK抑制劑法舒地爾可阻斷糖尿病肝纖維化大鼠Rho激酶信號通路，減少炎癥因子的產(chǎn)生，繼而影響NF-κB的激活和轉(zhuǎn)位發(fā)揮抗炎作用，從而減輕炎癥反應(yīng)，延緩肝纖維化的進展。
　　2.法舒地爾通過抑制四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中Rho A/

25、ROCK通路的激活，調(diào)控 Bcl-2/Bax比例，下調(diào) caspase-3的表達，從而抑制細胞凋亡，延緩肝纖維化的發(fā)展。
　　3.Rho A/ROCK通路被抑制能夠減輕豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝損傷大鼠模型的氧化應(yīng)激水平，改善肝臟受損狀態(tài)，延緩肝纖維化發(fā)生。
　　綜上所述，在肝纖維化的發(fā)展過程中，Rho A/ROCK通路被激活。ROCK抑制劑法舒地爾可以通過降低炎癥反應(yīng)、減少細胞凋亡、抑制氧化應(yīng)激等多種途徑減輕肝臟損傷，減少膠原表