花生過敏原Ara h2免疫親和層析分離方法的建立.pdf

1、花生是八大類致敏食物之一，其造成的過敏癥狀嚴重，發(fā)生率較高，而且不隨過敏患者年齡的增長而消減，引起了社會的廣泛關(guān)注。在目前已發(fā)現(xiàn)的13種花生過敏蛋白中，Ara h2蛋白占花生總蛋白含量的10％左右，能夠被90%花生過敏患者血清識別，是花生的主要過敏原之一。過敏原蛋白的分離提取為其致敏研究所必須，故其純化方法的建立具有重要的研究價值。本論文以Ara h2為研究對象，通過獲取相應(yīng)抗體，進行免疫親和層析柱制備，并將自制柱應(yīng)用于生花生及加工花生

2、產(chǎn)物中Ara h2的純化。
　　論文的研究工作包括利用天然花生Ara h2制備兔抗Ara h2多克隆抗體并分離；Ara h2免疫親和層析柱的制備；熱加工花生蛋白產(chǎn)物中Ara h2純化。研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下：
　　1.采用離子交換層析法從天然花生中分離Ara h2，并通過SDS-PAGE對分離蛋白純度進行鑒定；利用分離得到的高純度的Arah2作為免疫原，采用多點皮下注射免疫日本大耳白兔，獲得抗Ara h2的兔多克隆抗

3、體，并通過ELISA和免疫印跡方法檢測其效價和特異性；以分離得到的高純度的Ara h2和溴化氫活化的sepharose-4B柱材作為親和介質(zhì)材料，制備了從兔抗Ara h2血清中分離純化抗Ara h2多克隆抗體的親和層析柱，并利用SDS-PAGE和werstern blot進行鑒定。
　　結(jié)果顯示：純化得到的天然Ara h2純度高達90%以上，其多克隆抗體效價高，特異性強。同時制備得到抗Ara h2多克隆抗體的親和層析柱偶聯(lián)率95.

4、1%，抗體/柱材結(jié)合比率為17.1mg/g。SDS-PAGE結(jié)果表明通過該層析柱子分離得到的抗花生過敏原Ara h2特異性抗體純度高；免疫印跡法鑒定表明該抗體特異性非常高，ELISA檢測效價為1:6400，相對于上樣血清，抗體被富集了100倍以上。
　　2.利用純化得到的抗Ara h2多克隆抗體與溴化氫活化的sepharose-4B柱材相偶聯(lián)制備了用于分離Ara h2蛋白免疫親和層析柱，并對該自制柱偶聯(lián)率、柱容量、回收率、使用次數(shù)

5、等參數(shù)進行了表征。
　　結(jié)果顯示：該Ara h2蛋白免疫親和層析柱偶聯(lián)率為90.4%，抗體的介質(zhì)密度為18.1mg/g，該自制柱柱容量約0.55-0.60mg，Ara h2回收率在92.7%-97.8%之間，在使用11次后其柱容量仍保持原柱容量的87.5%，說明自制柱具有優(yōu)良的重復(fù)使用性能。
　　3.以生花生粗蛋白液為基本樣品分別進行水煮15、30、45、60、90min加工處理，之后對兩種樣品進行15min、30min、4

6、5min、60min、90min體外模擬胃消化和5min、15min、30min、60min、90min體外模擬胃腸消化。以Gly-HCl(pH2.7)作為洗脫液，利用自制Ara h2蛋白免疫親和層析柱對生花生、水煮花生、胃消化、腸消化產(chǎn)物中Ara h2蛋白進行分離，并通過SDS-PAGE和werstern blot對分離產(chǎn)物進行鑒定，利用ELISA方法分別測定生花生、水煮花生胃消化、腸消化產(chǎn)物中Ara h2的提取率。
　　結(jié)果顯

7、示：水煮處理造成了花生粗蛋白復(fù)雜聚集，不同的水煮時間形成的電泳條帶差異不顯著，尤其是Ara h2蛋白帶；體外模擬胃消化使生花生和水煮花生蛋白粗提液發(fā)生不同程度消化，Ara h2蛋白具有較強抗胃液消化；在體外模擬胃腸消化中生花生和水煮花生蛋白粗提液中的蛋白質(zhì)都被消化降解，Ara h2蛋白消化也很明顯。利用自制Ara h2蛋白免疫親和層析柱從生花生、水煮花生胃消化、腸消化產(chǎn)物成功分離出Ara h2蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示生花生粗提液樣