N-糖基化對乙型腦炎病毒感染與免疫保護特性的研究.pdf

1、乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)是一種危害嚴重的人獸共患蟲媒傳染病,是人類中樞神經系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一。其病原體是乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV),該病毒不僅侵害人的神經系統(tǒng),導致人的死亡,而且還可以引起種豬的繁殖性障礙,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。N-糖基化對乙型腦炎病毒的作用還不清楚,開展乙型腦炎病毒的N-糖基化的研究,對于揭示N-糖蛋白對該病毒感染與增殖的影

2、響,以及去N-糖基化DNA疫苗的免疫效果具有重要科學和實踐意義。本課題研究去N-糖基化修飾對乙型腦炎病毒感染和增殖的作用,還通過一系列除去N-糖基化的突變體prME和NS1蛋白免疫小白鼠,初步了解N-糖基化對免疫的重要作用。
　　 1.N-糖基化對JEV感染和增殖作用的研究
　　 用糖苷內切酶PNGase F和Endo H處理乙型腦炎病毒,以切去乙型腦炎病毒表面的N.糖鏈,將酶切后的乙型腦炎病毒進行Westrn blot

3、試驗以觀察去糖基化情況,同時將糖工酶處理的JEV接種BHK-21細胞進行蝕斑試驗,觀察蝕斑的大小及病毒滴度的變化情況,以研究N-糖基化在病毒侵染過程中的作用。同時用衣霉素處理BHK-21細胞并同步接種乙型腦炎病毒,進行蝕斑試驗,觀察蝕斑大小的變化與病毒增殖情況,以研究N-糖基化在病毒增殖過程中的作用。結果顯示,由Endo H和PNGase F處理的乙型腦炎病毒形成的蝕斑均顯著小于未經處理的病毒對照,病毒增殖滴度顯著降低。衣霉素處理細胞后

4、,病毒產生的蝕斑大小沒有明顯差異,但增殖滴度顯著降低。通過本研究說明,N-糖鏈對乙型腦炎病毒感染與增殖過程中均具有重要作用,切除乙型腦炎病毒表面的N-糖鏈后,乙型腦炎病毒感染能力與增殖能力顯著下降。
　　 2.N-糖基化對JEV基因免疫效果的研究
　　 用N-糖基化預測軟件,對乙型腦炎病毒的prME和NS1蛋白的基因序列進行分析,預測出其各有兩個潛在的N-糖基化位點,設計定點突變引物,參考點突變試劑盒的原理,利用PCR方

5、法進行定點突變,消除乙型腦炎病毒prME和NSI基因的N-糖基化位點,測序鑒定正確后,構建prME和NS1基因突變的真核表達質粒,分別為prM的第15個氨基酸位點突變的mcprME15,E的第154個氨基酸位點突變的mcprME154,prM的第15個氨基酸位點和E的第154個氨基酸位點雙突變的mcprME15154,NS1的第130個氨基酸位點突變的mc NS1130,NS1的第207個氨基酸位點突變的mc NS1207,NS1的第1

6、30和207兩個氨基酸位點雙突變的mcNS1130207,以及未突變的pcprME和pcNS1。對照組包括真核表達載體pcDNA3.1對照、乙型腦炎病毒SA14-14-2弱毒疫苗對照和空白對照。將上述質粒以5μg/只劑量免疫四周齡雌性小白鼠,于首免后兩周加強免疫一次,一免后兩周和二免后兩周采集小鼠血液,血清進行ELISA抗體檢測與中和抗體的檢測,于二免后兩周對小鼠進行攻毒,做免疫保護力統(tǒng)計。結果顯示,乙型腦炎病毒prME蛋白及其消除N-

7、糖基化位點的蛋白免疫小白鼠,均能誘導小鼠產生ELISA抗體、中和抗體和免疫保護力,消除單個N-糖基化的mcprME15和mcprME154與未消除糖基化pcprME刺激小鼠產生的抗體、中和抗體以及免疫保護力大體相同,消除兩個N-糖基化位點的prME蛋白誘導小鼠產生的抗體、中和抗體和免疫保護力低于未突變蛋白；NS1蛋白及其消除N-糖基化位點蛋白的能誘導小鼠產生較好的免疫保護力,消除單個N-糖基化位點的NS1蛋白誘導小鼠產生的保護率高達到1