三聚氰胺、沙丁胺醇及苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)的研究和應(yīng)用.pdf

1、三聚氰胺、瘦肉精等食品安全事件的頻發(fā)，使得食品安全問(wèn)題一再成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。因而，建立快速檢測(cè)三聚氰胺、瘦肉精類(lèi)物質(zhì)的方法迫在眉睫。本研究分別建立了測(cè)定食品中三聚氰胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法(ic-ELISA)。
　　三聚氰胺是一種重要的三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，然而，由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，因而一些不法分子為降低成本在小麥粉、飼料、奶粉等植物性或動(dòng)物性高蛋白類(lèi)食品中添加這種非食品性化工原料

2、，以提高其產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量。三聚氰胺本身為低毒性，但如果與三聚氰酸并用，會(huì)形成無(wú)法溶解的氰尿酸三聚氰胺，造成嚴(yán)重的腎結(jié)石。2004年、2007年先后爆發(fā)的寵物毒糧事件，2008年的三鹿奶粉事件，均是由于非法添加三聚氰胺。因而，急需建立高靈敏度、高特異性、快速、可靠的定量/篩選三聚氰胺的分析方法。在本研究中，為增強(qiáng)檢測(cè)牛奶、奶粉、飼料樣品中三聚氰胺酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)的靈敏度和特異性，采用了合理的半抗原修飾和異型抗體/包被抗

3、原組合策略。采用2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(CAAT)和三聚氰胺作為原料，合成了三種連有不同長(zhǎng)度的連接臂末端帶羧基的三聚氰胺衍生物，并與載體蛋白偶聯(lián)制得免疫原和包被抗原。采用雜交瘤技術(shù)成功的制備了抗三聚氰胺的單克隆抗體。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下， ELISAs法測(cè)定三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍為0.1-100 ng/mL，IC50值在1.7–3.9 ng/mL之間。與已報(bào)道文獻(xiàn)相比，靈敏度增強(qiáng)了10-300倍。同時(shí)ELISAs的交叉

4、反應(yīng)率值也證實(shí)了該分析方法的高特異性。本實(shí)驗(yàn)選擇了純牛奶、奶粉、飼料等五種樣品作為加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)樣品，用于 ELISA測(cè)定，回收率在72.8–133.0%之間，批內(nèi)變異系數(shù)(coefficients of variation, CV)為0.8–18.9%(n=3)，批間CV為2.6-20.8%(n=3)。與HPLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.9902，相關(guān)性好。因而所建立的ELISA法經(jīng)證實(shí)是一種可行的定量/篩選三聚氰胺的分析方法。
　　

5、β-激動(dòng)劑即為俗稱(chēng)的瘦肉精類(lèi)物質(zhì)，因食用含有β-激動(dòng)劑殘留的畜產(chǎn)品而發(fā)生的中毒事件已屢見(jiàn)不鮮，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部先后多次頒布公告，明令禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用β-激動(dòng)劑。沙丁胺醇是繼克倫特羅之后最常被濫用的一種β-激動(dòng)劑，所以對(duì)其性質(zhì)及檢測(cè)方法的研究也越來(lái)越引起人們的重視。在本研究中，合成了三種連有不同長(zhǎng)度連接臂的沙丁胺醇包被抗原和免疫原，成功的制備出抗沙丁胺醇的兩種多克隆抗體，建立了高靈敏度、高特異性的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISAs法，并

6、用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)證實(shí)了該法測(cè)定動(dòng)物組織和飼料樣品時(shí)的可靠性。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，基于兩種抗體/兩種包被抗原的四種組合條件下測(cè)定沙丁胺醇得到的ELISAs方法的IC50值在0.21-0.33 ng/mL之間，表明建立的ELISA方法具有很高的靈敏度。同時(shí)ELISA的交叉反應(yīng)率值也證實(shí)了該分析方法的高特異性。選擇豬肉和豬飼料樣品做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在90.6–120.2%，批內(nèi) CV為8.4–21.1%(n=3)，批

7、間 CV為2.9-14.3%(n=3)，與LC-MS-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.9950，相關(guān)性好。因而，該ELISA法經(jīng)證實(shí)是一種可行的檢測(cè)沙丁胺醇的分析方法。
　　苯乙醇胺A是一種在中國(guó)非法使用的新型β-激動(dòng)劑。本研究中，建立了一種高靈敏度高特異性的檢測(cè)動(dòng)物組織和飼料樣品中苯乙醇胺 A的間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA法，并用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)進(jìn)行了方法的證實(shí)。通過(guò)還原硝基為氨基合成苯乙醇胺 A衍生物，采用重氮化法與載

8、體蛋白偶聯(lián)。考察了免疫的四只兔的抗血清的靈敏度和特異性。所有的血清均表現(xiàn)出高靈敏度，IC50值均低于0.48 ng/mL。所建立的最靈敏的 ELISA法的靈敏度 IC50和檢出限 LOD分別為0.049 ng/mL和0.003 ng/mL。四種抗血清與萊克多巴胺、克倫特羅和沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率均低于0.39%，與其余6種可添加于動(dòng)物飼料中的藥物（包括兩種結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)：異丙腎上腺素、去氧腎上腺素）無(wú)交叉反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)選擇了豬腎、豬肝、豬肉