硝酸鹽還原作用對地衣芽胞桿菌合成聚γ-谷氨酸的影響分析.pdf

1、硝酸鹽是一種微生物可利用的重要無機(jī)氮化合物。硝酸鹽在還原酶作用下經(jīng)亞硝酸鹽后形成氨離子。這個代謝過程對微生物具有多種生理功能，或可作為電子受體而穩(wěn)定細(xì)胞膜質(zhì)子梯度，或可維持胞內(nèi)NAD/NADH的平衡，或可為微生物提供氮源。雖然硝酸鹽還原作用的生理功能在許多微生物中被考察，但是對合成聚γ-谷氨酸（γ-PGA）的影響并沒有被研究。本文首先考察硝酸鹽對地衣芽胞桿菌WX-02合成γ-PGA發(fā)酵的影響。同時，建立了針對γ-PGA發(fā)酵液樣品的代謝組

2、學(xué)樣品處理方法。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用G-C-MS分析手段，研究了代謝水平上硝酸鹽代謝同γ-PGA合成之間的關(guān)系。最后，通過構(gòu)建硝酸鹽還原酶缺失菌株，考察了不同硝酸鹽還原酶在γ-PGA發(fā)酵過程中的具體生理功能。主要結(jié)論如下:
　　 1、代謝學(xué)中常規(guī)采用的離心和膜過濾的菌體分離方法對具有粘性的γ-PGA發(fā)酵液并不適用。酸處理的方法會對造成菌體死亡，并且死亡程度隨pH的增加而增加。同時，稀釋-離心方法和物理研磨方法只能獲得不超過30％的菌

3、體收得率。在選擇的六種淬滅溶劑（無水甲醇、無水乙醇、甲醇/乙醇混合液、10M鹽酸、飽和三氯乙酸和高氯酸）中，無水乙醇最合適。同時，熱乙醇是五種抽提方法（熱甲醇、熱乙醇、冷甲醇、冷乙醇、高氯酸凍融）中最合適的。基于乙醇的代謝組學(xué)樣品處理方法能為GC-MS檢測提供更強(qiáng)的分離效果、更多的代謝物和更好的穩(wěn)定性。
　　 2、硝酸鹽能有效地提高地衣芽胞桿菌WX-02的γ-PGA合成能力，其發(fā)酵終點的γ-PGA產(chǎn)量從22.28 mg/mL提高

4、至35.23 mg/mL。硝酸鹽代謝不僅提高了菌體對胞外谷氨酸的利用程度，也強(qiáng)化了胞內(nèi)谷氨酸的合成能力。在γ-PGA發(fā)酵過程中，硝酸鹽還原作用同糖酵解和氮循環(huán)的過程有著緊密關(guān)聯(lián)。同時，硝酸鹽還原作用受到了溶氧水平的顯著影響。此外，地衣芽胞桿菌WX-02對硝酸鹽和亞硝酸鹽的耐受能力受培養(yǎng)基的營養(yǎng)豐富程度的影響。
　　 3、樣品中檢測到的代謝物覆蓋了糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑、有機(jī)酸代謝和氨基酸代謝等。γ-PGA的合成時，糖酵解途徑

5、、三羧酸循環(huán)途徑的代謝活性會提高，而硝酸鹽還原作用會進(jìn)一步強(qiáng)化這種激活作用從而促進(jìn)更多的γ-PGA被合成。可見，硝酸鹽還原作用引起的地衣芽胞桿菌WX-02胞內(nèi)代謝調(diào)節(jié)程度要比γ-PGA合成更深。同時，6-磷酸葡萄糖（葡萄糖進(jìn)入糖酵解的第一代謝物）、谷氨酸和谷氨酰胺（氮循環(huán)的主要代謝物）的胞內(nèi)池容積的變化表明它們可能是地衣芽胞桿菌WX-02代謝網(wǎng)絡(luò)中對γ-PGA合成和硝酸鹽還原作用都響應(yīng)的重要節(jié)點。此外，部分代謝物的合成顯示出依賴性。L-

6、半胱氨酸只出現(xiàn)在硝酸鹽還原作用下，而三磷酸甘油醛、戊二酸和L-丙氨酸在γ-PGA合成時積累，乙酰乙酸、丙二酸和L-纈氨酸則只在不合成γ-PGA狀態(tài)下積累。丙酸是唯一的需兩個作用都存在才積累的胞內(nèi)代謝物。
　　 4、呼吸硝酸鹽還原酶是地衣芽胞桿菌WX-02在γ-PGA合成期間的唯一的硝酸鹽還原酶。同化硝酸鹽還原酶對菌株的亞硝酸鹽還原過程產(chǎn)生巨大的影響。在地衣芽胞桿菌WX-02γ-PGA發(fā)酵過程中，硝酸鹽還原作用是一個呼吸-同化過程