糖酵解途徑和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的改造對大腸桿菌發(fā)酵L-蘇氨酸的影響.pdf

1、L-蘇氨酸是人類必需氨基酸，在醫(yī)藥、食品、飼料領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。在大腸桿菌高密度發(fā)酵過程中，易形成副產(chǎn)物乙酸，抑制菌體生長并且降低L-蘇氨酸產(chǎn)量。此外，改造L-蘇氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，有利于降低胞內(nèi)L-蘇氨酸濃度，從而解除其對關(guān)鍵酶的反饋作用，可能是提高L-蘇氨酸產(chǎn)量的重要策略。
　　大腸桿菌中乙酸生成的主要原因是碳源溢流，即糖酵解代謝流高于TCA循環(huán)代謝流，敲除L-蘇氨酸生產(chǎn)菌THRD中糖酵解關(guān)鍵酶基因pyk和pfk，減弱糖酵解途徑代謝

2、流，以減少溢流碳源進而減少乙酸的生成。利用5L發(fā)酵罐進行分批補料發(fā)酵實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THRD△pykF，THRD△pykA，THRD△pfkA和THRD△pfkB乙酸濃度分別降為原菌的47.80％、19.54％、1.52％和35.39％。與原菌相比，THRD△pykF和THRD△pykAL-蘇氨酸的產(chǎn)量分別提高了11.05％和5.35％(112.57±2.82、106.79±2.80 vs.101.37±2.79g/L)，糖酸轉(zhuǎn)化率分別

3、提高了10.91％和5.60％。THRD△pfkA缺失株因生長緩慢產(chǎn)酸低，THRD△pfkB的產(chǎn)L-蘇氨酸水平與原菌THRD相差不大。隨后構(gòu)建了雙基因敲除菌THRD△pfkB△pyk，THRD△pfkB△pykF的L-蘇氨酸產(chǎn)量與THRD△pykF相差不大，但乙酸積累量降低了21.35％。另外，除了THRD△pfkA的NADPH濃度降低外，其他重組菌株的NADPH生成量均高于原菌。上述結(jié)果證明，在THRD中適當(dāng)?shù)母脑焯墙徒馔緩侥軌蛴行У?/p>

4、減弱糖酵解途徑代謝流，減少乙酸生成，進而有益于L-蘇氨酸合成。
　　由于大腸桿菌乙酸的生成與糖攝取有很大關(guān)系，改造糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)也是減少乙酸的重要策略。以L-蘇氨酸生產(chǎn)菌TRFC為出發(fā)菌株敲除在糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中起重要作用的EⅡ CBGlc的編碼基因ptsG。搖瓶結(jié)果顯示，TRFC△ptsG產(chǎn)酸水平與原菌相近，乙酸積累量降低了22.83％。在5L分批補料發(fā)酵過程中，其L-蘇氨酸產(chǎn)量僅為原菌的58.30％。說明ptsG的敲除能有效地降低乙酸，

5、但不利于大腸桿菌TRFC高產(chǎn)L-蘇氨酸。
　　在大腸桿菌中敲除sstT能降低胞外L-蘇氨酸吸收速率，過表達rhtC能增加胞內(nèi)L-蘇氨酸的輸出速率。構(gòu)建TRFC sstT基因缺失株，搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，與原菌相比，其L-蘇氨酸產(chǎn)量提高了4.00％。隨后在TRFC△sstT重組菌基礎(chǔ)上進一步過表達rhtC基因，TRFC△sstT+pSTV28-rhtC的L-蘇氨酸產(chǎn)量比TRFC△sstT+pSTV28提高了18.16％。另外，測定了四個